ripa裂解液.doc

ripa 裂解液 RIPA 主要是从动物组织和动物细胞中抽取的可溶性蛋白。 1. 基本信息组成: 50 mM Tris-HCl (pH ), 150 mM NaCl, 1% NP-40,% SDS.( 配有一支 PMSF). 使用 RIPA 裂解达到的蛋白样品,可以用 BCA 蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。由于含有较高浓度的去污剂, 不能用 Bradfor d 法测定 RIP A 裂解后的蛋白浓度。保存:4℃; 避光 RIPA 裂解液(RIPA Lysis Buffer) 是一种传统的细胞组织快速裂解液。 RIPA 裂解液裂解得到的蛋白样品可以用于常规的 Western 、 IP 等。 RIPA 的本意是 Radio Immunoprecipitation Assay 。 RIPA 裂解液的配方有很多种,根据其裂解液的强度大致可以分为强、中、弱三类。关于不同的 RIPA 裂解液以及我们生产的其它裂解液的主要特点和差异,以及如何选择裂解液可参考附录。 3. 使用方法对于培养细胞样品: 1. 融解 RIPA 裂解液,混匀。取适当量的裂解液,在使用前数分钟内加入 PMSF ,使 PMSF 的最终浓度为 1mM 。 2. 对于贴壁细胞: 去除培养液,用 PBS 、生理盐水或无血清培养液洗一遍( 如果血清中的蛋白没有干扰,可以不洗) 。按照 6 孔板每孔加入 150-250 微升裂解液的比例加入裂解液。用枪吹打数下, 使裂解液和细胞充分接触。通常裂解液接触细胞 1-2 秒后, 细胞就会被裂解。对于悬浮细胞: 离心收集细胞,用手指把细胞用力弹散。按照 6 孔板每孔细胞加入 150-250 微升裂解液的比例加入裂解液。再用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。如果细胞量较多,必需分装成 50-100 万细胞/ 管,然后再裂解。裂解液用量说明: 通常 6 孔板每孔细胞加入 150 微升裂解液已经足够,但如果细胞密度非常高可以适当加大裂解液的用量到 200 微升或 250 微升。对于组织样品: 1. 把组织剪切成细小的碎片。 2. 融解 RIPA 裂解液,混匀。取适当量的裂解液,在使用前数分钟内加入 PMSF ,使 PMSF 的最终浓度为 1mM 。 3. 按照每 20 毫克组织加入 150-250 微升裂解液的比例加入裂解液。( 如果裂解不充分可以适当添加更多的裂解液,如果需要高浓度的蛋白样品,可以适当减少裂解液的用量。) 4. 用玻璃匀浆器匀浆,直至充分裂解。 5. 充分裂解后, 10000-14000g 离心 3-5 分钟, 取上清, 即可进行后续的 PAGE 、 Wester n 和免疫沉淀等操作。 6. 如果组织样品本身非常细小, 可以适当剪切后直接加入裂解液裂解, 通过强烈 vorte x 使样品裂解充分。然后同样离心取上清, 用于后续实验。直接裂解的优点是比较方便, 不必使用匀浆器,缺点是不如使用匀浆器那样裂解得比较充分。注: RIPA 裂解液的裂解产物中经常会出现一小团透明胶状物,属正常现象。该透明胶状物为含有基因组 DNA 等的复合物。在不检测和基因组 DNA 结合特别紧密的蛋白的情况下, 可以直接离心取上清用于后续实验; 如果需要检测和基因组结合特别紧密的蛋白, 则可以通过超声处理打碎打散该透明胶状物,随后