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葡聚糖凝胶柱的使用方法.
葡聚糖凝胶柱的使用方法.
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葡聚糖凝胶柱的使用方法.
葡聚糖凝胶柱的使用方法：
(1) 预处理
称取SephadexG-25 〔50－100 目〕约5g，参加蒸馏水 100ml ，置
是以被别离物质的分子量差异为根底的一种层
析别离技术，这一技术为纯化蛋白质等生物大分子提供了一种非常温和的别离方法。
层析的
固定相载体是凝胶颗粒，目前应用较广的是：具有各种孔径范围的葡聚糖凝胶〔
Sephadex〕
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葡聚糖凝胶柱的使用方法.
和琼脂糖凝胶〔Sepharose〕。
葡聚糖凝胶是由直链的葡聚糖分子和交联剂
3—氯1，2—环氧丙烷交联而成的具有多孔
网状结构的高分子化合物。凝胶颗粒中网孔的大小可通过调节葡聚糖和交联剂的比例来控
制，交联度越大，网孔结构越紧密；交联度越小，网孔结构就越疏松，网孔的大小决定了被
别离物质能够自由出入凝胶内部的分子量范围。可别离的分子量范围从几百到几十万不等。
葡聚糖凝胶层析，是使待别离物质通过葡聚糖凝胶层析柱，
各个组分由于分子量不相同，
在凝胶柱上受到的阻滞作用不同，
而在层析柱中以不同的速度移动。
分子量大于允许进入凝
胶网孔范围的物质完全被凝胶排阻，
不能进入凝胶颗粒内部，
阻滞作用小，随着溶剂在凝胶
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葡聚糖凝胶柱的使用方法.
颗粒之间流动，因此流程短，而先流出层析柱；分子量小的物质可完全进入凝胶颗粒的网孔内，阻滞作用大，流程延长，而最后从层析柱中流出。假设被别离物的分子量介于完全排阻和完全进入网孔物质的分子量之间，那么在两者之间从柱中流出，由此就可以到达别离目的。
本实验以葡聚糖凝胶G—25作为固定相载体，来别离蓝色葡聚糖—2000和溴酚蓝。蓝色葡聚糖—2000分子量接近2×106，而溴酚蓝分子量为670，二者分子量相差较大，前者完全排阻，而后者那么可完全进入凝胶颗粒网孔内，二者通过层析柱的时间不同而分开。
【实验材料】
实验器材
层析柱(1×20cm)附有一小段乳胶管及螺旋夹；洗脱液瓶 (带下口的三角瓶， 250m1)；
试管及试管架；量筒 10m1；721型分光光度计
实验试剂
Tris—醋酸缓冲液():取Tris溶液(含KCl)900ml，用浓醋酸调pH至，加蒸馏水至1000m1。
溴酚蓝溶液：称取溴酚蓝10毫克，溶于5毫升乙醇中，充分搅拌使其溶解，然后逐滴参加Tris—醋酸缓冲液()至溶液呈深蓝色。
(3) 蓝色葡聚糖—2000溶液：称取蓝色葡聚糖— 2000 10毫克，溶于2毫升Tris—醋酸
缓冲液()中即成。
样品溶液：取溴酚蓝溶液毫升，蓝色葡聚糖—2000溶液毫升混匀后为上柱样品溶液。
葡聚糖凝胶G-25(Sephadex-G-25)
【实验操作】
实验凝胶的制备：商品凝胶是枯燥的颗粒，使用时需经溶胀处理，称取4克葡聚糖凝
胶G—25，加50毫升蒸馏水，搅拌均匀，在室温溶胀
6小时，或沸水浴溶胀
2小时，一般
采用后一种方法。再用倾泻法除去凝胶上层水及细小颗粒，
用蒸馏水反复洗涤几次，再以缓
冲溶液(