蛋白酶活性检验方法.docx

蛋白酶活性检验方法 1定义 1g 固体酶粉(或 1mL 液体酶),在一定温度和 PH 值条件下, 1min 水解酪素产生 1ug 酪氨酸为一个酶活力单位,以( u/ mL )表示。 2 福林法(第一法) 2、1原理蛋白酶在一珲的温度与 PH条件下,水解底物, 产生含有酚基的氨基酸(如:酪氨酸、色氨酸等),在碱性条件下, 将福林试剂( Folin )还原,生成钼蓝与钨蓝,用分光度法测定, 计算其酶活力。 2、2 试剂和溶液 2、2、1 福林试剂的制备于 2000mL 磨口回流装置中加入钨酸钠( Na 2 Wo 4· 2H 2O) 100g 、钼酸钠( Na 2 MoO 4· 2H 2O) 25g 、水 700mL 、 85 %磷酸 50mL 、浓盐酸 100mL ,水火沸腾回流 10h ,取下回流冷却器,在通风橱中加入硫酸锂( Li 2 SO 4) 50g 、水 50mL 和数滴浓溴水( 99 %),再微沸 15min ,以除去多余的溴(冷后人有绿色需再加溴水,再煮沸除去过量的溴),冷却, 见水定溶至 1000ml 。混匀, 过滤。制得的试剂应呈金黄色, 贮存于棕色瓶内。使用溶液:一份福林试剂与二份水混合, 摇匀。 2、2、2碳酸钠溶液 c( Na 2 CO 3 )= 称取无水碳酸钠( Na 2 CO 3) ,用水溶解并定容至 1000 mL 。 2、2、3三氯乙酸 c( CCl3 · COOH ) = 称取三氯乙酸 ,用水溶解并定容至 1000 mL 。 2、2、4 氢氧化钠溶液 c( NaOH ) = 按 GB601 配制。 2、2、5盐酸溶液 c( HCI )= 1 mol/L 及 mol/L 按 GB601 配制。 2、2、6缓冲溶液 a 、磷酸缓冲液( PH= )适用于中性蛋白酶称取磷酸氢二钠( Na 2 HPO 4· 12H 2O) 和磷酸二氢钠( NaH 2 PO 4· 12H 2O) ,加水溶解并定容至 1000mL 。 b 、乳酸缓冲液( PH= )适用于酸性蛋白酶甲液称取乳酸( 80 %~ 90 %) ,加水溶解并定容至 1000 mL 。乙液称取乳酸钠( 70 %) 16g ,加水溶解并定容至 1000 mL 。使用溶液取甲液 8 mL ,加乙液 1 mL ,混匀,稀释一倍,即成 乳酸缓冲溶液。 c 、硼酸缓冲溶液( PH= )适用于碱性蛋白酶甲液称取硼酸钠(硼砂) ,加水溶解并定容至 1000 mL 。乙液称取氢氧化钠 ,加水溶解并定容至 1000 mL 。使用溶液取甲液 500 mL 、乙液 400 mL 混匀,用水稀释至 1000mL 。上述各种缓冲溶液,均须用 PH计校正。 2、2、7 10g/L 酪素 3 )溶液称取酪素 ,精确至 ,用少量 氢氧化钠溶液(若酸性蛋白酶则用浓乳酸 2~3 滴) 湿润后,加入适量的各种适宜 PH 的缓冲溶液约 80 mL ,在沸水浴中边加热边搅拌,直到完全溶解,冷却后, 转入 100 mL 容量瓶中,用适宜的 PH 缓冲溶液稀释至刻度。此溶液在冰箱内贮存,有效期为