溶菌酶试验综合型实验(实验报告定稿).(DOC).doc

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第1章引言生化技术重要理论
蛋白质称盐析，将
大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子（如硫酸铵的
SO4 和 NH4) 有很强的水化力，可夺取蛋
白质分子的水化层， 使之 “失水 ”，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。
盐析时若溶液
pH 在蛋白质等电
点则效果更好。由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样，因
此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。
影响盐析的因素有： （ 1）温度：除对温度敏感的蛋白质在低温（
4 度）操作外，一般可在室温中进
行。一般温度低蛋白质溶介度降低。但有的蛋白质（如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白）在较高的温
度（ 25 度）比 0 度时溶解度低，更容易盐析。
（ 2）pH 值：大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中
的溶介度最低。 （ 3）蛋白质浓度：蛋白质浓度高时，欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质地一起
沉淀出来（共沉现象） 。因此在盐析前血清要加等量生理盐水稀释，使蛋白质含量在
-% 。
蛋白质盐析常用的中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。
其中应用最多的
硫酸铵， 它的优点是温度系数小而溶解度大
（25 度时饱和溶液为
，即 767 克 /升； 0 度时饱和溶
解度为 ，即 676 克 /升），在这一溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以盐析出来；另外硫酸铵
分段盐析效果也比其他盐好，不易引起蛋白质变性。硫酸铵溶液的
pH 常在 - 之间，当用其他
pH 值进行盐析时，需用硫酸或氨水调节。
蛋白质在用盐析沉淀分离后，需要将蛋白质中的盐除去，常用的办法是透析，即把蛋白质溶液
装入秀析袋内 （常用的是玻璃纸） ，用缓冲液进行透析， 并不断的更换缓冲液， 因透析所需时间较长，
所以最好在低温中进行。此外也可用葡萄糖凝胶 G-25 或 G-50 过柱的办法除盐，所用的时间就比较
短。
等电点沉淀法
蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力最小，因而溶解度也最小，各种蛋白质的等电点有差别，可利用调节溶液的 pH 达到某一蛋白质的等电点使之沉淀，但此法很少单独使用，可与盐析法结合用。
低温有机溶剂沉淀法
用与水可混溶的有机溶剂，甲醇，乙醇或丙酮，可使多数蛋白质溶解度降低并析出，此法分辨力比盐析高，但蛋白质较易变性，应在低温下进行。
根据蛋白质分子大小的差别的分离方法
透析与超滤
透析法是利用半透膜将分子大小不同的蛋白质分开。
超滤法是利用高压力或离心力，强使水和其他小的溶质分子通过半透膜，而蛋白质留在膜上，可选择不同孔径的膜截留不同分子量的蛋白质。
凝胶过滤法
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也称分子排阻层析或分子筛层析，这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。柱
中最常用的填充材料是葡萄糖凝胶（ Sephadex gel）和琼脂糖凝胶（ agarose gel）。
根据蛋白质带电性质进行分离
蛋白质在不同 pH 环境中带电性质和电荷数量不同，可将其分开。
电泳法
各种蛋白质在同一 pH 条件下，因分子量和电荷数量不同而在电场中的迁移率不同而得以分开。值得重视的是等电聚焦电泳，这是利用一种两性电解质作为载体，电泳时两性电解质形成一个由正
极到负极逐渐增加的 pH 梯度，当带一定电荷的蛋白质在其中泳动时， 到达各自等电点的 pH 位置就停止，此法可用于分析和制备各种蛋白质。
离子交换层析法
离子交换剂有阳离子交换剂（如：羧甲基纤维素； CM- 纤维素）和阴离子交换剂（二乙氨基乙基纤
维素； DEAE?FONT FACE=" 宋体 " LANG="ZH-CN"> 纤维素），当被分离的蛋白质溶液流经离子交换
层析柱时，带有与离