杀菌剂生物测定技术.ppt

杀菌剂生物测定技术
孢子萌发法
　　　　　　　　　　管碟法
含毒介质培养法　　　滤纸片法 　　　抑菌圈法
　　　　　　　　　　孔碟法 　
　　　　　　　　　生长速率法
　　　　　　　　　最小浓度法
叶碟法
三、杀菌剂室内主要生培养而且抑菌圈清楚的均可采用。
影响抑菌圈法测定结果的因素
特别是为某一特定病害寻求有效的防治药剂时，实际上不可能对供试菌进行选择，但以水平扩散法作生物定量测定，如抗菌素效价测定，则必须对供试菌有如下的要求：
对被测定的药剂有适当的敏感性，抑菌圈界限明显
培养容易，生长迅速不易为杂菌污染　不易发生变异
容易作成接种菌液（菌丝体或孢子悬浮液）
菌种有较强的耐热能力
2　对药剂的要求　
　 用抑菌圈法测定一种药剂的抑菌作用的大小，有一定的局限性。如与该药剂的理化性质有密切的关系。如是否容易扩散。若有很好的扩散性能，就能真实反映该药剂的杀菌毒力。如由于大多数抗生素都有一定的水溶性，因此，抑菌圈法为抗生素的科研和生产广泛采用。而有相当一部分杀菌剂的原药是不易溶解于水，故扩散性不好，要用该法，就要用适量的乙醇或丙酮溶解后，再用水稀释至所需的浓度。
有效好的水溶性
将不同浓度的药液和热的培养基混合，用这种含毒培养基培育病，以病原菌的生长进度的快慢来判定药剂的毒力大小。
（2）生长速率法原理
有2种：
①　菌落达到一定的大小所需时间，
　
②　一定时间内菌落的直径大小。
病原菌生长的表示方法
优点：
①　操作比较简单　
②　适用范围广，适用于乳油、水剂、可湿性粉剂等
③　重复性好。只要操作认真，均可得到可靠的结果
生长速率法的优缺点
缺点：
对供试菌种要求严格，病菌要易于培养，生长较快且边缘　整齐、产孢子缓慢，而且是农业生产上重要的的病原菌。
对供试药剂要求，有一定的耐热性，遇热不易分解。
苹果腐烂病菌（Valsa mali）
小麦纹枯病菌（Rhzoctonia solani ）
棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporium）
葡萄白腐病菌（Coniothyrium diplodiella）
小麦全蚀病菌（Gaeumannomyces graminis）
辣椒疫霉病菌（Phytophthora capsici）
生长速率法常用的菌种
（1）制备菌饼：用无菌的打孔器在供试菌种边缘打下菌块即菌饼（在无菌条件下进行）
（2）含毒培养基的制备：奖供试药剂稀释成一系列梯度浓度后，准确取一定量的药液加入到热的培养基中，混匀，倒入灭菌的小培养皿中（直径为6cm），待冷凝后即为含毒培养基
生长速率法
（3）移植菌饼　用接种针或消毒的摄子将菌饼反面（有菌丝的一面向下和培养基贴合）移植到带毒培养基平板上，一个培养皿最好接一个菌饼。
（4）测定菌落直径　恒温培养到预定时间后，取出培养皿测量菌落直径。每个菌落十字交叉测两次直径。
生长速率法示意图
菌饼
含药剂的培养基
菌饼
含毒培养基
纯生长量＝菌落直径－菌饼直径
　　　　对照的纯生长量－处理的生长量
抑制率＝――――――――――――X100
　　　　　对照的纯生长量
计算公式
将算出的各处理（浓度）的抑制率换成机率值，以对数表示浓度，用作图法或最小二乘法求出EC50或EC95，并以此比较毒力。
毒力方程的计算
在比较粗放的进行几种杀菌剂的毒力比较时，可以采用最低抑制浓度法。
（3）最低抑制浓度法
最小浓度法基本原理
　 是药剂按等比或等差级数系列浓度和培养基混合后接入供试菌，定温培养一定时间后，找出“终点”（明显地抑制供试菌生长发育的最高稀释倍数，即最低浓度）的那个浓度，即为最低抑制浓度。通过比较几种不同药剂的最抵抑制浓度即可比较其毒力。显然，最低抑制浓度最小的，其毒力最大。
根据培养基是固态还是液态又将最低抑制浓度法分为
液体培养基稀释法
固体培养基稀释法
取若干只灭菌试管，顺序编号，在每只试管中加入适合供试菌生长的液体培养基Nml，然后在第一号试管中加入一定浓度的供试药液Xml，充分混合后自第一管中取Nml放入第二管，充分混合后取Xml加入第3管，直到最后一管不加药液作为对照。自倒数第二管中取出Xml弃去不用，如此所得的一系列浓度顺序相差一倍。
液体培养基稀释法
在各管中加入供试菌悬浮液一滴，在该供试菌最适温度下培养一定时间，取出观察“终点”，一般以混浊度为准，即以某编号试管以下不再发生明显混浊现象，这一试管的浓度就是最低抑制浓度。
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