miR-22通过靶向UCP2保护心肌细胞免受硫酸吲哚酚诱导的凋亡和过度自噬.pdf

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·70·2022Jan1
网络出版时间::网络出版地址::
2021/12/221540https//.
miR-22通过靶向UCP2保护心肌细胞免受
硫酸吲哚酚诱导的凋亡和过度自噬
郭影梁婷王学忠
,,
摘要目的探讨尿毒症微环境下对心肌细胞心肌细胞的自噬水平[2]但是尚不清楚诱导的
miRNA-22。,IS
凋亡和过度自噬的影响并阐明该过程的潜在机制方法
,。心肌细胞自噬水平的更深层机制解偶联蛋白
收集硫酸吲哚酚刺激后的细胞分别将模。2
(IS)H9c2,miR-22位于线粒体内膜在心
拟物抑制剂和(uncouplingprotein2,UCP2),
(mimic-miR-22)、miR-22(anti-miR-22)UCP2肌组织中广泛表达[3]研究[4]表明可以通过
过表达物转染入细胞采用流式细胞术分析。UCP2
(LeUCP2)。抑制活氧性生成来保护心肌细胞免受氧化应激引起
细胞的存活情况和分析自噬相关蛋白
H9c2Westernblot的凋亡和过度自噬据报道[5]
的表达结果与接受对照处理的细胞相。,miRNA-22(miR-22)
LC3、p62。H9c2在心脏中高度表达并作为心脏重塑的重要调节剂
比组的存活细胞数量减少vsP
,ISH9c2(%%,<,。
而凋亡和坏死细胞的数量却增加vs然而是否通过保护心肌细胞免受
),(%%,,miR-22UCP2IS
vsP用模拟物治疗可减少诱导的凋亡和过度自噬尚不清楚该研究探讨
%%,<)。miR-22。miR
坏死和凋亡细胞的百分比vsvs在调节诱导的心肌细胞自噬作用及其可能
(%%,%-22IS
P而用抑制剂治疗可增加凋亡和坏机制
%,<),miR-22。
死细胞的百分比vsvsP
(%%,%%,<材料与方法
分析显示模拟物转染的1
)。Westernblot,miR-22H9c2
细胞与相应的阴性对照转染的细胞相比具有更低的

比率vsP
LC3-Ⅱ/Ⅰ[(±)(±),<111试剂胎牛血清购自美国公
而蛋白表达提高vs..10%HyClone
],p62[(±)(±司改良培养基购自美国
P而抑制剂则产生了相反的结果;DulbeccoEagleThermo
),<];miR-22公司二甲基噻唑基二苯
比值vsPScientific;3-(4,5--2-)-2,5-
[LC3-Ⅱ/Ⅰ:(±)(±),<;基溴化四唑
vsP此外与空
p62:(±)(±),<]。,-2H-(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-
慢病毒载体对照相比转染导致暴露于的脂质体转染
,LeUCP2ISH9c2diphenyltetrazoliumbromide,MTT)、2000
细胞或抑制剂转染的细胞中表达增加P试剂硫酸吲哚酚均购自美国公司
miR-22H9c2p62(、Sigma-Aldrich;
比率降低P结论通乳酸脱氢酶测量试剂盒
<),LC3-Ⅱ/Ⅰ(<)。miR-22(lacticdehydrogenase,LDH)
过靶向在减轻诱导的心肌细胞凋亡和自噬方面起购自美国公司模拟物
UCP2ISPromega;miR-22(mimic-miR-
着重要保护作用抑制剂和过表达
。22)、miR-22(anti-miR-22)UCP2
关键词硫酸吲哚酚心肌细胞解偶联蛋白物均购自上海吉玛制药技术有限公司
;;miRNA-22;2;(LeUCP2);
自噬试剂检测试
中图分类号TRIzol、MicroRNAqRT-PCRSybrGreen

文献标志码文章编号、SYBRRT-PCRTakaraBio-
A1000-1492(2022)01-0070-07公司裂解缓冲液购自美国
chemical;RocheApplied
doi:.issn1000-
Science;PVDFMerckMillipore
司抗体抗体抗体抗
研究[1]表明硫酸吲哚酚在;p-62、LC3Ⅰ/Ⅱ、UCP2、Bcl-2
,(indoxylsulfate,IS)体抗体抗体和抗体均购自
慢性肾病患者中观察到的心血管疾病进程中起促进、Bax、caspase-3β-actin
美国公司辣根过氧化物
作用体外实验证实了通过增强氧化应激上调CellSignalingTechnology;
。IS酶结合的第二抗体购自美国公司膜联蛋白
Abcam;
接收
2021-10-27和碘化丙啶检测试剂盒购自美国
基金项目宁夏自然科学基金编号V-FITC(PI)BD
:(:2020AAC03366)公司突变株试剂盒购自德国
作者单位宁夏医科大学总医院心脏中心内科银川Biosciences;QuikStrat-
:,750004公司载体购自美国公司
作者简介郭影女硕士副主任医师
:,,,;agene;pmiRGLOPromega。
王学忠男硕士主任医师责任作者112仪器酶标仪购自美国公
,,,,,E-mail:546921182..FL-600BioTek
司实时系统购自美国公
***@;PCRAppliedBiosystems
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2022Jan1·71·
司利用化学发光检测系统购自上海公司引物正向
;Tanon;miR-22,5'-GCCTGAAGCTGCCAGTTGA-3'
购自美国和反向大鼠引
-Dickin-5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3';U6
公司双荧光素酶报告系统购自美国公物正向和反向
son;Promega,5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'5'-
司引物正向
。AACGCTTCACGAATTTGCGT-3';β-actin,

H9c25'-CGACCACACACAGAGGGAGAT-3'5'-GC-
公司将其培养在含有胎牛血清的引物正向
ATCC,10%Dul-CGATTCACACCGAGTA-3';UCP2,5'-TGC
改良培养基和反向
beccoEagle。TGAGCTGGTGACCTATG-3'5'-CCAGGGCAG

MTTAGTTCATGTAT-3'。

。H9c296,PBS,
度的中在另有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的冰冷裂解缓冲液
IS(100、250、500、1000μmol/L)48h。
一个实验中将与孵育中裂解细胞然后在下离心
,H9c2500μmol/LIS24、48、。12000r/min4℃10
用处理后将工作溶液在凝胶上分离等量的细胞裂
72h。IS,20μlMTT(5mgmin。10%SDS-PAGE
溶于磷酸盐缓冲液添加到每个孔中解物并转移到膜上这些膜在
MTT/ml,PBS),(20μg),PVDF。
并在下孵育弃上清液将沉淀用中用吐温在室温下阻断然后将
37℃5h。,150μlTBST5%-202h,p-
二甲基亚砜溶解使用酶抗体抗体
(DMSO)10min。FL-60062(1∶1000)、LC3Ⅰ/Ⅱ(1∶800)、UCP2
标仪在波长处检测吸光度为了验证数据抗体抗体抗体
570nm。,(1∶800)、Bcl-2(1∶2000)、Bax
每个测定进行了次抗体和
3。(1∶1000)、caspase-3(1∶1000)β-actin

ISH9c2(1∶1000)4℃。,
胞毒性作用使用测量试剂盒测定细胞释放的在室温下用辣根过氧化物酶结合的第二抗体孵育
,LDH1
具体操作为将接种在孔板中然后利用化学发光检测系统对抗体复合物进行了可
LDH。:H9c296,h。
暴露于连续浓度的视化和定量分析用相对密度法测定靶蛋白表达水
IS(100、250、500、1000μmol/L)。
中吸取上清液转移至孔酶法测定平并将其标准化为对应的条带
48h。50μl96,β-actin。

,50μl。V-FITC
板在室温下避光孵育最后加入停止液化丙啶检测试剂盒对细胞进行了染色并通过
,30min。,,(PI),
并用酶标仪在处记录吸光度实验流式细胞仪分析细胞存活情况首先使用胰蛋白
FL-600490nm。。,
进行了次以验证结果酶消化细胞5个然后将细胞在室温下于黑
3。(6×10),

H9c2,5100μl5μlAnnexinV-FITC5μl
4个孔接种于孔板用脂质体转染试的结合缓冲液中然后将结合缓冲
×10/24,2000PI10min,400μl
剂分别将液添加至混合物中在停止反应后内通过流式
,mimic-miR-22(50nmol/L)、anti-miR-22。1h
和转染入细胞细胞术分析细胞使用
(100nmol/L)LeUCP2(50nmol/L)。。
加入乱码或空慢病毒载体作为对照转染评估流式细胞仪数据每组共计数个细胞进
miR-22。。10000
后收集细胞并进行以下测定行统计分析每次评估重复次
48h,。,3。

TRIzol5'-AAACG-
试剂从培养的细胞中分离了总为了量化和
RNA。GACTCGCAGCGAGCTCCAG-3'5'-CGACTCTAGA
的表达使用针对特定的特通过
miR-22miRNA,miRNACTAGATACATGACTCTAACATTTGCC-3'PCR
殊茎环引物合成然后使用扩增含有推定的靶位点的的野生型
cDNA,MicroRNAqRT-miR-22UCP2
检测试剂盒和序列检测实时非翻译区的片段同时通过
PCRSybrGreen7500(WT)3'(3'UTR-WT)。
系统确定表达水平比较阈值周使用突变株试剂盒对载体
PCRmiRNA。Ct(QuikpGL3-UCP2-3'UTR
期值用于量化表达水平为了量化上带有的靶点序列中的序列
)miRNA。UCP2miR-22seedsequence
的表达使用试剂盒合成进行点突变随后将包含的或
mRNA,SYBRRT-PCRcD-。,UCP23'UTR-WT
并进行分析和分别作为突变型片段插入紧邻荧光素酶基因
NART-PCR。U6β-actin3'UTR-MUT()
和的内部对照和表序列下游的载体中在报告分析中该研
miRNAmRNA。miRNAmRNApmiRGLO。,
达水平以相对于对应对照样品表达水平的倍数变化究用荧光素酶报告构建物和
mimic-miR-22、anti-
表示并使用-ΔΔCt方法计算实验使用引物如下或阴性对照共转染了细胞
,2。:miR-22miRNAsH9c2。
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转染后裂解细胞用双荧光素酶报告系统测定胞来诱导过表达和敲低转染效率如图
48h,,miR-22。
荧光素酶活性荧光素酶活性水平被标准化为肾素所示与对照组相比模拟组中的
。2A、B,,miR-22miR-
荧光素酶活性水平水平升高P而抑制剂组中的
。22(<),miR-22

-22(<)。IS
分析数据采用xs表示两组间比较采用t检验下与接受对照处理的细胞相比组的存活
,■±,,,H9c2,IS
多组间比较采用单因素方差分析以P细胞数量减少tP而凋亡
(ANOVA),<H9c2(=,=),
为差异有统计学意义所有实验独立重复和坏死细胞的数量却增加了tP
。3(=、,=
次用模拟物治疗可减少坏死
。、)。miR-22
和凋亡细胞的百分比tP
2结果(=、,=、
而用抑制剂治疗可进一步增加凋亡
),miR-22
、毒性和自噬的影响和坏死细胞的百分比tP
(=、,<)
分析结果显示可以剂量依赖性地抑制图
MTT,IS(2C、D)。
-22对IS诱导的自噬的影响
H9c2(1A),,Westernblot
由诱导的增殖的抑制作用增分析显示在暴露于条件下模拟物转染的
500μmol/LISH9c2,IS,miR-22
加图同时用或细胞与相应的阴性对照转染的细胞相
(1B)。,500μmol/L1000μmol/LH9c2miRNA
处理可增加中的释放图比具有更低的比值tP
IS48hH9c2LDH(1C)。LC3-Ⅱ/Ⅰ(=,<),
此外分析显示可以剂量依赖性地蛋白表达提高tP图
,Westernblot,ISp62(=,=)(3A、B);
降低细胞中的表达FP而抑制剂则产生了相反的结果tP
H9c2p62(=,<miR-22(=,
并促进向转化FtP图
),LC3-ⅠLC3-Ⅱ(=,=;p62:=,=)(3C、D)。
-22靶向UCP2和
<,1D、E)。qRT-PCRWesternblot
-22对IS诱导的H9c2细胞凋亡的影响分析表明在暴露于条件下模拟物转染的
,IS,miR-22
为了检查对处理过的心肌细胞的作用细胞与相应的阴性对照转染的细胞相
miR-22IS,H9c2miRNA
研究通过用模拟物或抑制剂转染细比具有更高的和蛋白表达t
miR-22H9c2UCP2mRNA(=、
图1IS对H9c2细胞增殖、毒性和自噬的影响
法检测不同浓度对细胞增殖的影响法检测不同处理时间对细胞增殖的影响不同浓度对细
A:MTTISH9c2;B:MTTISH9c2;C:ISH9c2
胞毒性的影响不同浓度对细胞蛋白表达及比值的结果和定量数据与对照组比较△P
;D、E:ISH9c2p62LC3-Ⅱ/ⅠWesternblot;:<,
△△P△△△P
<,<
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图2miR-22对IS处理过的心肌细胞的作用
分析模拟物抑制剂或相应的阴性对照n转染的细胞中表达与对照组比较∗∗∗P
A、B:qRT-PCRmiR-22、miR-22(=3)H9c2miR-22;:<
流式细胞术分析显示对细胞坏死凋亡和存活的影响n与正常组比较∗P∗∗P∗∗∗P
;C、D:miR-22H9c2、(=3);:<,<,<
与组比较#P##P
;IS:<,<
P而抑制剂则产生高表明转染的效率很高与空慢病毒载
,=、);miR-22,LeUCP2。
了相反的结果tP体对照相比转染导致暴露于的细
(=、,=、)。,LeUCP2ISH9c2
为了证实与之间的关系研究进行了胞或抑制剂转染的细胞中
miR-22UCP2,miR-22H9c2Bcl-2/Bax
双重荧光素酶报告基因检测结果显示在比率和表达增加tP
。,UCP2p62(LeUCP2=、,<
组中与阴性对照转染细胞相比tP
3'UTRWT,,miR-、;anti-miR-22=、,<、
模拟转染的细胞中标准化萤光素酶活性水平增加以及和比值降低
)cleaved-caspase3LC3-Ⅱ/Ⅰ
tP而在抑制剂转染的细胞中则tPt
(=,<),(LeUCP2=、,=、;anti-miR-22=
降低tP但是在P
(=,=)。UCP23'、,=、)。
组中用模拟物或抑制剂转染后的荧
MUT,miR-223讨论
光素酶构建体的活性水平较阴性对照未发生变化
。
见图尿毒症性心肌病是慢性肾病最常见的并发症
4。,
-22在IS刺激H9c2细胞中的其病死率较高是目前有关心血管疾病
。MicroRNA
保护作用分析结果见图所示的研究重点该研究表明上调可通过抑制
Westernblot5,。,miR-22
转染的细胞中表达水平明显升细胞凋亡和过度自噬来保护心肌细胞免受诱导
LeUCP2H9c2UCP2IS
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图3miR-22对IS诱导自噬的影响
模拟物对细胞蛋白表达及比值的结果和定量数据抑制物对细胞
A、B:miR-22H9c2p62LC3-Ⅱ/ⅠWesternblot;C、D:miR-22H9c2p62
蛋白表达及比值的结果和定量数据正常组组组组组
LC3-Ⅱ/ⅠWesternblot;1:;2:IS;3:mimic-miR-22-IS;4:mimic-NC+IS;5:anti-miR-22-IS;
组与正常组比较∗P∗∗P∗∗∗P与或组比较#P##P###P
6:anti-NC+IS;:<,<,<;mimic-NC+ISanti-NC+IS:<,<,<

图4miR-22靶向UCP2
分析转染模拟物抑制剂或相应阴性对照后的细胞中表达水平模拟
A、B:qRT-PCRmiR-22、miR-2248hH9c2UCP2mRNA;C~F:miR-22
物抑制剂对细胞中蛋白表达的结果和定量数据与或组比较∗P∗∗P
、miR-22H9c2UCP2Westernblot;mimic-NC+ISanti-NC+IS:<,<
在的和中的预测结合位点双荧光素酶报告基因测定模拟物和抑制剂转染
;G:miR-22UCP2WT3'UTRMUT3'UTR;H、I:miR-22miR-22
的细胞中的荧光素酶活性水平正常组组组组组组与
H9c2;1:;2:IS;3:mimic-miR-22-IS;4:mimic-NC+IS;5:anti-miR-22-IS;6:anti-NC+IS;
或组比较△△P与或组比较##P###P
mimic-NCanti-NC:<;mimic-miR-22+UCP23'UTRanti-miR-22+UCP23'UTR:<,<
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图5UCP2介导miR-22在IS刺激H9c2细胞中的作用
分析对暴露于的细胞中和蛋白表达
A、B:WesternblotLeUCP2ISH9c2UCP2、Bcl-2、Bax、cleaved-caspase3、p62、LC3-ⅠLC3-Ⅱ;C、D:West-
分析对暴露于且接受抑制剂转染的细胞中和蛋白表达
ernblotLeUCP2ISmiR-22H9c2UCP2、Bcl-2、Bax、cleaved-caspase3、p62、LC3-ⅠLC3-Ⅱ;
组组组组与或组
1:LeUCP2+IS;2:Le-NC+IS;3:LeUCP2+IS+anti-miR-22;4:Le-NC+IS+anti-miR-22;Le-NC+ISLe-NC+IS+anti-miR-22
比较∗P∗∗P∗∗∗P
:<,<,<
的损伤机理研究[5]表明直接靶向抑制活氧性生成和抑制氧化应激而对心血管系统具
。,miR-22UCP2,
过表达保护心肌细胞免受凋亡和过度自噬有保护作用此外抑制会降低细胞内+
UCP2。。,UCP2NAD
该研究揭示了诱导性心肌病的潜在机制和的水平最终导致细胞功能障碍和死亡[14]
。ATP,。
据报道[6-7]在几种癌症中异常表达虽然在心血管疾病中的作用已得到广泛研
,miR-22,UCP2
并且其在这些癌症中的作用已得到广泛研究研究但是是否会影响尿毒症性心肌病发病过
。,,UCP2
究[8]表明与多种心肌疾病有关通程中的自噬过程尚不清楚以往在线数据库进行的
miR-22,miR-22。
过直接靶向抑制心肌肥大[9]研究靶基因预测研究[15]已表明可以
TNNI3K。LietalMicroRNAmiR-22
表明通过靶向调节饥饿诱导的心肌靶向因此该研究选择作为
,miR-22p38αUCP2。,UCP2miR-22
细胞自噬和凋亡在其他研究中[10]揭示调控诱导的心肌细胞凋亡和过度自噬中的
。,YangetalISH9c2
了抑制了缺血再灌注诱导的心肌坏死和炎靶标结果显示上调可以在和蛋白
miR-22/,,miR-22mRNA
症因此有利于损伤后的心肌修复该研究旨在通质水平上提高表达而下调可以降低
,,。UCP2,miR-22
过模拟体内尿毒症微环境阐明在刺激下表达双荧光素酶报告基因检测结果证实
,ISmiR-22UCP2。
对心肌细胞凋亡和自噬的影响有研究[11]显示尿与相互作用此外该研究表明通过
。,miR-22UCP2。,
毒症患者的血清水平升高了约倍而慢性肾用慢病毒预处理心肌细胞来上调可以
IS50,H9c2UCP2
病患者的血清最高浓度可超过通减轻诱导的细胞凋亡和过度自噬结果表明
IS500μmol/L。IS。,
常将范围内的浓度用于体外对心肌细胞存活具有有利影响研
100~1000μmol/LISLeUCP2H9c2。
研究[12]因此该研究也选择此浓度范围来进究还表明消除了抑制剂对诱导
。,ISLeUCP2miR-22IS
行体外实验结果显示在刺激下通过的心肌细胞的促凋亡和自噬作用因此
。,IS,miR-22H9c2。,
抑制细胞凋亡和自噬促进细胞存活可能是的下游效应物并可能介导
。UCP2miR-22,
研究[13]表明位于线粒体内膜中的通过对诱导的心肌细胞损伤的作用
,UCP2miR-22IS。
安徽医科大学学报ActaUniversitatisMedicinalisAnhui;57()
·76·2022Jan1
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