基因工程第4章 目的基因的制备.ppt

6学时
教学重点:基因组文库、cDNA文库及筛选文库方法的原理及操作规程。
第一节目的基因的制备
第二节目的基因的分离
第四章目的基因的制备与分离
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第一节目的基因的制备
一、直接分离法
1、限制性核酸内切酶酶切分离法
已知序列基因.
酶切后分离
与适当载体重组
转入受体。
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plasmid
BamHI
BamHI
Plasmid-1
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2、物理化学法
密度梯度离心法:不同大小的DNA被分开,再用探针杂交检验。
单链酶解法:G C间三键,A T间双键,适当温度解开AT多的链,GC多的链未解开,用单链酶降解单链,剩下GC链。
分子杂交法:利用探针分子通过分子杂交固定相关基因。
是基因在发展初期所用的方法
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3、双抗体免疫法
蛋白质已分离纯化,并制备了它的抗体1。
mRNA合成蛋白质时与核糖体蛋白质结合形成聚合体。
分离这种蛋白质聚合体,与制备好的抗体1进行免疫反应。再加入抗体1的抗体进行免疫反应。
分离这种反应产物,再去除蛋白质,剩下mRNA,反转录后合成cDNA。
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去蛋白提取RNA,反转录合成cDNA
cDNA
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二构建基因组文库
从生物组织细胞提取出全部DNA,
将DNA酶切成预期大小的片段,
将这些片段与适当的载体连接,转入受体细菌或细胞,
每一个细胞接受了含有一个基因组DNA片段, 许多细胞一起组成一个含有基因组各DNA片段克隆的集合体.
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1、基因文库的概念
某种生物的基因组的遗传信息通过克隆载体贮存在一个受体菌的群体之中,这个群体即为这种生物的基因组DNA文库(genomic DNA library)
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2、基因文库的大小
一个理想的基因组文库应该是在克隆群体中包含完整基因组的所有DNA序列。
DNA片段要有足够的长度,保证含有某个完整的基因序列。
估算:基因组文库的克隆数目=基因组DNA总长/DNA片段的平均长度。
如:3×106 kb/15kb=2×105
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