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PCR基础理论
一、半保留复制及转录、逆转录
(1)DNA的半保留复制(semiconservative replication)
DNA是所有原核生物和真核生物遗传的主要物质基础。在这些生物中遗传信息以遗传密码的形式编码在DNA分子上,表现为特定的核苷酸排列顺序,并通过DNA复制(replication)由亲代传给子代。在DNA合成进行时,以两条亲代DNA链中的每一条链为模板,在DNA指导下的DNA聚合酶催化下,按A与T、G与C碱基配对原则合成子代DNA的过程称DNA的复制。由于复制合成的子代DNA两条脱氧核糖核苷酸链中有一条来自亲代DNA,另一条是以前者为模板新合成的子代DNA链,所以DNA的这种合成作用又称半保留复制(图1)。
(2)RNA的转录(transcription)过程
以DNA为模板合成RNA的过程称为转录(transcription)。转录是生物界RNA合成的主要方式,是遗传信息由DNA向RNA传递过程,也是基因表达的开始。转录也是一种酶促的核苷酸聚合过程,所需的酶叫做依赖DNA的RNA聚合酶(DNA-dependent RNA polynerase ,DDRP)。转录产生初级转录物为RNA前体(RNA precursor),它们必须经过加工过程变为成熟的RNA,才能表现其生物活性。
RNA的转录合成从化学角度来讲类似于DNA的复制,多核苷酸链的合成都是以5’→3’的方向,在3’-OH末端与加入的核苷酸磷酸二酯键,但是,由于复制和转录的目的不同,转录又具有其特点:(1)对于一个基因组来说,转录只发生在一部分基因,而且每个基因的转录都受到相对独立的控制;(2)转录是不对称的。(3)转录时不需要引物,而且RNA链的合成是连续的。
转录的主要过程分为识别与起始、延长和终止三个阶段。
(3)RNA的逆转录(reverse transcription)过程
以RNA为模板,根据碱基配对原则,按照RNA的核苷酸顺序(其中U与A配对)合成DNA。这一过程与一般遗传信息流转录的方向相反,故称为逆转录,催化此过程的DNA聚合酶叫做逆转录酶(reverse transcriptase)。
大多数反转录酶都具有多种酶活性,主要包括以下几种活性。①DNA聚合酶活性;以RNA为模板,催化dNTP聚合成DNA的过程。②RNase H活性;由反转录酶催化合成的cDNA与模板RNA形成的杂交分子,将由RNase H从RNA5′端水解掉RNA分子。③DNA指导的DNA聚合酶活性;以反转录合成的第一条DNA单链为模板,以dNTP为底物,再合成第二条DNA分子。除此之外,有些反转录酶还有DNA内切酶活性。反转录酶的发现对于基因工程技术起了很大的推动作用,目前它已成为一种重要的工具酶。
二、PCR技术的基本原理与PCR技术的特点
聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR),又称无细胞分子克隆系统或体外酶促基因扩增法。PCR技术是由Kary B Mullis于1985年联合创造的。该技术可将极微量的靶DNA特异地扩增上百万倍,从而大大提高对DNA分子的分析和检测能力,能检测单分子DNA或对每10万个细胞中仅含1个靶DNA分子的样品。
PCR技术的基本原理
其原理类似于DNA的天然复制过程,PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成。
①模板DNA的变性
模板DNA经加热至93℃左右一段时间后,模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应做准备;
②模板DNA与引物的退火(复性)
模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;
③引物的延伸
DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链,重复循环变性-退火-延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,这种新链又可成为下次循环的模板,每完成一个循环需2-4分钟,2-3个小时就能将待扩目标基因扩增放大几百万倍。
PCR反应五要素
参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+。
PCR反应条件
PCR反应条件为温度、时间和循环次数,温度、时间和循环次数的设置对PCR的成功与否至关重要。
1、温度与时间的设置
基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法,双链DNA在90~95℃变性,再迅速冷却至40 ~60℃,引物退火并结合到靶序列上,然后快速升温至70~75℃,在TaqDNA聚合酶的作用下,使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为100~300bp)可采