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PCR 培训教材 1 PCR 基础理论一、半保留复制及转录、逆转录(1)DNA 的半保留复制(semiconservative replication) DNA 是所有原核生物和真核生物遗传的主要物质基础。在这些生物中遗传信息以遗传密码的形式编码在 DNA 分子上,表现为特定的核苷酸排列顺序, 并通过 DNA 复制(replication) 由亲代传给子代。在 DNA 合成进行时,以两条亲代 DNA 链中的每一条链为模板,在 DNA 指导下的 DNA 聚合酶催化下,按A与T、G与C 碱基配对原则合成子代 DNA 的过程称 DNA 的复制。由于复制合成的子代 DNA 两条脱氧核糖核苷酸链中有一条来自亲代 DNA ,另一条是以前者为模板新合成的子代 DNA 链,所以 DNA 的这种合成作用又称半保留复制(图 1)。(2)RNA 的转录( transcription ) 过程以 DNA 为模板合成 RNA 的过程称为转录( transcription ) 。转录是生物界 RN A 合成的主要方式, 是遗传信息由 DNA 向 RNA 传递过程, 也是基因表达的开始。转录也是一种酶促的核苷酸聚合过程,所需的酶叫做依赖 DNA 的 RNA 聚合酶( DNA-dependent RNA polynerase ,DDRP ) 。转录产生初级转录物为 RNA 前体( RNA precursor ) ,它们必须经过加工过程变为成熟的 RNA ,才能表现其生物活性。 PCR 培训教材 2 RNA 的转录合成从化学角度来讲类似于 DNA 的复制, 多核苷酸链的合成都是以 5 ’→ 3’的方向,在 3’-OH 末端与加入的核苷酸磷酸二酯键,但是,由于复制和转录的目的不同, 转录又具有其特点:(1) 对于一个基因组来说, 转录只发生在一部分基因, 而且每个基因的转录都受到相对独立的控制;(2) 转录是不对称的。(3) 转录时不需要引物,而且 RNA 链的合成是连续的。转录的主要过程分为识别与起始、延长和终止三个阶段。(3)RNA 的逆转录( reverse transcription ) 过程以 RNA 为模板, 根据碱基配对原则, 按照 RNA 的核苷酸顺序( 其中 U与A 配对) 合成 DNA 。这一过程与一般遗传信息流转录的方向相反,故称为逆转录,催化此过程的 DNA 聚合酶叫做逆转录酶(reverse transcriptase) 。大多数反转录酶都具有多种酶活性,主要包括以下几种活性。① DNA 聚合酶活性;以 RNA 为模板, 催化 dNTP 聚合成 DNA 的过程。② RNase H 活性; 由反转录酶催化合成的 cDNA 与模板 RNA 形成的杂交分子,将由 RNase H从 RNA5 ′端水解掉 RNA 分子。③ DNA 指导的 DNA 聚合酶活性; 以反转录合成的第一条 DNA 单链为模板,以 dNTP 为底物, 再合成第二条 DNA 分子。除此之外, 有些反转录酶还有 DN A 内切酶活性。反转录酶的发现对于基因工程技术起了很大的推动作用, 目前它已成为一种重要的工具酶。二、 PCR 技术的基本原理与 PCR 技术的特点聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR), 又称无细胞分子克隆系统或体外酶促基因扩增法。 PCR 技术是由 Kary B Mullis 于 1985 年联合创造的。该技术可将极微量的靶 DNA 特异地扩增上百万倍,从而大大提高对 DNA 分子的分析和检测能力, 能检测单分子 DNA 或对每 10 万个细胞中仅含 1 个靶 DNA 分子的样品。 PCR 技术的基本原理其原理类似于 DNA 的天然复制过程, PCR 由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成。①模板 DNA 的变性模板 DNA 经加热至 93℃左右一段时间后, 模板 DNA 双链或经 PCR 扩增形成的双链 DNA 解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应做准备; ②模板 DNA 与引物的退火( 复性) 模板 DNA 经加热变性成单链后,温度降至 55℃左右,引物与模板 DNA 单链的互补序列配对结合; ③引物的延伸 DNA 模板-引物结合物在 TaqDNA 聚合酶的作用下,以 dNTP 为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链,重复循环变性-退火-延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”, 这种新链又可成为下次循环的模板,每完成一个循环需 2-4 分钟, 2-3 个小时就能将待扩目标基因扩增放大几百万倍。 PCR 反应五要素参加 PCR 反应的物质主要有五种即引物、酶、 dNTP 、模板和 Mg 2+。 PCR 培训教材 3 PCR 反应条件 PCR