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脯氨酸含量测定
在逆境条件下(旱、盐碱、热、冷、冻),植物体内脯氨酸(proline,Pro)的含量显著增加。植物体内脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性,抗旱性强的品种往往积累较多的脯氨酸。因此测定脯氨酸含量可以作为抗旱育种的生理指标。另外,由于脯氨酸亲水性极强,能稳定原生质胶体及组织内的代谢过程,因而能降低冰点,有防止细胞脱水的作用。在低温条件下,植物组织中脯氨酸增加,可提高植物的抗寒性,因此,亦可作为抗寒育种的生理指标。
一、原理
用磺基水杨酸提取植物样品时,脯氨酸便游离于磺基水杨酸的溶液中,然后用酸性茚三酮加热处理后,溶液即成红色,再用甲苯处理,则色素全部转移至甲苯中,色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波长下比色,从标准曲线上查出(或用回归方程计算)脯氨酸的含量。
二、材料、仪器设备及试剂
(一)材料:待测植物(水稻、小麦、玉米、高粱、大豆等)叶片。
(二)仪器设备:1. 722型分光光度计;2. 研钵;3. 100ml小烧杯;4. 容量瓶;5. 大试管;6. 普通试管;7. 移液管;8. 注射器;9. 水浴锅;10. 漏斗;11. 漏斗架;12. 滤纸;13 剪刀。
(三)试剂
1. 酸性茚三酮溶液:(8ml85%磷酸定容至20ml)中,搅拌加热(70℃水浴)溶解,贮于(4度)冰箱中(2-3天有效);
2. 3%磺基水杨酸:3g磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至100ml;(密封避光)
3. 冰醋酸;
4. 甲苯。
三、实验步骤
1. 标准曲线的绘制
(1)在分析天平上精确称取25mg(10mg)脯氨酸(-20度,现稀释现用),倒入小烧杯内,用少量蒸馏水溶解,然后倒入250ml(100ml)容量瓶中,加蒸馏水定容至刻度,此标准液中每ml含脯氨酸100μg。取此液10ml稀释至100ml,即成10ug/ml脯氨酸标准液。
(2)各试管中试剂加入量:
0 1 2 3 4 5 6
标准脯氨酸量 0
蒸馏水 2 0
冰乙酸 2 2 2 2 2 2 2
酸性茚三酮 2 2 2 2 2 2 2
(3)取7支试管按上表加入各试剂,每管在沸水浴中加热40min。
(4)冷却后各试管准确加入5ml甲苯,振荡30S,静置10min,使色素全部转至甲苯溶液。(5)用注射器轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中,以甲苯溶液为空白对照,于520nm波长处进行比色。
(6)标准曲线的绘制:先求出吸光度值(Y)依脯氨酸浓度(X)而变的回归方程式,再按回归方程式绘制标准曲线,计算2ml测定液中脯氨酸的含量(μg/2ml)。
2. 样品的测定
(1)脯氨