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碱性磷酸酶km值测定实验报告
篇一:碱性磷酸酶Km值得测定与分子筛层析
碱性磷酸酶Km值得测定
【实验目的】
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【实验原理】
、pH及酶浓度恒定的条件下,酶促反应的初速度随底物浓度
[S]增大而增加,但底物浓度增大到一定极限时,则反应速度趋于恒定,即最大反应速度(Vmax)。反应速度与底物浓度之间的关系可用米氏方程来表示,即:
Vmax?[s]V?Km?[S]
,用磷酸苯二钠为其底物,生成酚和磷酸盐。酚在碱性溶液中与4-氨基安替比林作用,经铁氰化钾氧化生成红色醌的额衍生物,根据红色的深浅可测出酶活力高低。其反应如下:
磷酸苯二钠?H2O?????苯酚?Na2HPO4
苯酚?4-氨基安替比林???????醌类衍生物(红色)
【实验器材与试剂】
器材:试管架,试管,移液管,移液枪,恒温水浴箱,721型分光光度计
试剂:,pH=10碳酸缓冲液,蒸馏水,酶液,碱性溶液,4-氨基安替比林,铁氰化钾)6,OH?AKP,OH?
【实验步骤】
试剂 1 2 3 4 5 6 7 空白 底物液
pH= 10 碳酸缓冲液
蒸馏水
混合水浴37℃,预温5分钟
()
加入酶液后立即混匀,37℃水浴保温,反应开始。并开始计时,反应时间为15 min
4 - 替比林
2. 混匀,室温放置10min左右,以空白管调零,
测定各管的吸光度(A510)
时间步骤现象分析
15 :50 配好底物混合液无明显现象
并开始预热
15: 55 预热结束并加入酶液无明显现象
水浴15min
16: 07 水浴结束,依次加入 1-5号管红黄生成酚类碱性溶液等试剂,混颜色依次加深衍生物, 匀,置于室温下10min6,7管颜色不深6,7号管反应未完全 16: 17 测定各管吸光度
【实验结果记录与处理】
试管编号 12(转载自: 范文网:碱性磷酸酶km值测定实验报告)34567 8 数据处理
试管编号 1234567 8 10 0 mmol/L
1/[S] 21 1/ 以1/[S]为横轴,1/A510为纵轴作图:
【计算】
根据y = + ,当y=0时,x=-,继而Km=
【实践与思考】
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在底物浓度很低时,反应速度随底物浓度的增加而急骤加快,两者呈正比关系,随着底物浓度的升高,反应速度不再呈正比例加快,反应速度增加的幅度不断下降。如果继续加大底物浓度,反应速度不再增加,此时,无论底物浓度增加多大,反应速度也不再增加,说明酶已被底物所饱和。所有的酶都有饱和现象,只是达到饱和时所需底物浓度各不相同而已。
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不同的酶Km值不同,同一种酶与不同底物反应Km值也不同,Km值可近似的反应酶与底物的亲和力大小:Km值大,表明亲和力小;Km值小,表明亲合力大.
【注意事项】
。实验是粗测,本身存在实验误差,我们在操作过程中也造成误差,所以导致与实际值差距较大。
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分子筛层析(凝胶过滤法)
【实验目的】
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【实验原理】
,它们的内部有很细微的多孔网状结构。
,大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外,而小分子可以进入凝胶颗