SOD(超氧化物歧化酶)活性测定.doc

SOD(超氧化物歧化酶)活性测定氮蓝四唑法一、原理超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)普遍存在动、植物的体内,是一种清除超氧阴离子自由基的酶,它催化下面的反应:反应产物H2O2可由过氧化氢酶进一步分解或被过氧化物酶利用。超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑(NBT)在光下的还原作用来确定酶活性的大小。在有氧化物质存在下,核黄素可被光还原,被还原的核黄素在有氧条件下极易被氧化而产生超氧阴离子,超氧阴离子可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙,后者在560nm处有最大吸收。而SOD可清除超氧阴离子,从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后,反应液蓝色愈深,说明酶的活性愈低,反之酶的活性俞高。据此可计算出酶活性的大小。二、材料、仪器设备及试剂(一)材料植物器官(花瓣、叶片等)(二)仪器设备冰箱、低温高速离心机、微量加样器(1mL、20μL、100μL)、移液管、精密电子天平、UV-752型紫外分光光度计、试管、研钵、剪刀、镊子、荧光灯(反应试管处照度为4000Lux或Lx)(三)试剂(1)()。(2)130mmol/L甲硫氨酸(Met)溶液:。(3)750μmol/L氮蓝四唑溶液:,避光保存。(4)100μmol/LEDTA-Na2溶液:-Na2,用磷酸缓冲液定溶1000mL。(5)20μmol/L核黄素溶液:,避光保存。三、试验步骤(一)酶液的提取(1)称取植物材料(去叶脉),加1ml预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆,加缓冲液使体积为5mL。取2mL于1000r/min下离心20min,上清液即为SOD粗提液。(二)显色反应取5mL的试管(要求透明度好)若干,有对照、处理。按下表加样:试剂(酶)用量/mL终浓度//