谷胱甘肽的过量合成胞外积累及研究.pdf

苏州大学学位论文独创性声明本人郑重声明:所提交的学位论文是本人在导师的指导下,独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外,本论文不含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果,也不含为获得苏州大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体,均已在文中以明确方式标明。本人承担本声明的法律责任。论文作者签名:董塑煎日期:趔丝:垒:[里苏州大学学位论文使用授权声明本人完全了解苏州大学关于收集、保存和使用学位论文的规定,即:学位论文著作权归属苏州大学。本学位论文电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。苏州大学有权向国家图书馆、中国社科院文献信息情报中心、中国科学技术信息研究所(含万方数据电子出版社)、中国学术期刊(光盘舨)电子杂志社送交本学位论文的复印件和电子文档,允许论文被查阅和借阅,可以采用影印、缩印或其他复制手段保存和汇编学位论文,可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索。涉密论文口本学位论文属在——年一月解密后适用本规定。非涉密论文囱论文作者签名:盘蛰煎一El期:丝廛:垒&导师签名:甲侈◇二。/谷胱甘肽的过量合成及胞外积累研究中文摘要中文摘要谷胱甘肽(Glutathione,GSH),分为还原型和氧化型两种,在生物体内大量存在并起作用的是还原型谷胱甘肽。产朊假丝酵母(Candidautilis)属于Crabtree阴性和Kluyver阳性酵母,具有同时利用来源于生物质中的己糖和戊糖的能力,且代谢阻遏效应不明显,因而成为合成GSH理想的细胞工厂。目前酵母发酵法被认为是工业上生产GSH最具潜力的方法之一,而通过改变细胞生理状态提高GSH合成的研究才刚起步。本文通过采用酸胁迫和添加表面活性的手段或措施对酵母的生长和代谢进行调控,促使其过量合成目的产物并探讨了作用机制。主要研究内容如下:(1)分析比较了恒定pH和不控制pH条件下GSH的分批发酵过程,。,选择合适的酸胁迫时间分别为弱酸胁迫6h和强酸胁迫2h。采用分批补料培养方式,比较了不同酸胁迫条件下的GSH生物合成情况,发现长时间弱酸胁迫比短时间强酸胁迫和不胁迫更利于GSH的过量合成。最后,分别从分批发酵动力学、胞内辅因子以及各关键代谢物的代谢通量变化规律等角度对弱酸胁迫促进GSH过量合成的机理进行了定量分析。(2),发现后者由于gshl基因拷贝数的减少,细胞合成GSH的能力下降,胞内GSH的含量比前者下降了50%。接着对培养至18h的两菌株细胞分别实施了强酸胁迫和弱酸胁迫,发现弱酸胁迫对两菌株细胞的生长和GSH的合成没有太大的影响,而在强酸胁迫下,细胞生长受到一定抑制,GSH的总产量也比对照低,同时,强酸胁迫可以促进GSH向胞外分泌,特别是在CutilisAgshl细胞中,%。酸胁迫可以改变两菌株的胞内pH(pHi),特别是在强酸胁迫下,pHi有明显的下降,,能缓解这种下降趋势,更有利于细胞保持内环境稳态。通过分析酸胁迫前后胞内糖酵解关键酶活性的变化发现,强酸胁迫可导致己糖激酶(HK)、磷酸果糖激酶(PFK)、丙酮酸激酶(PK)活性大幅度的下降,而GSH浓度越高则越能缓解这种下降趋势。酸胁迫可引起胞内产生活性氧分子(ROS),中文摘要谷胱甘肽的过量合成及胞外积累研究通过检测两菌株细胞内SOD酶活性发现,在强酸胁迫下,由于CutilisAgshl胞内GSH浓度较出发菌株少,SOD酶活性提高了180%,%,说明GSH在清除ROS过程中也起着重要的作用。(3)考察了不同类型的表面活性剂对细胞生长、GSH合成及胞内外分布的影响。聚氧乙烯(20)月桂醚(Brij35)和聚氧乙烯(20)单油酸酯(Tween80)由于极性上的差异对细胞生长和GSH合成的作用也不一样。Brij35表现出对细胞生长的抑制作用,CutilisSZU07—01、%、5%、%。,%%;而Brij35则不会抑制CutilisAgshl的GSH合成能力;同时Brij35对三个菌株胞外GSH的积累不起作用。Tween8