牛乳铁蛋白肽（bLF+pep）的基因改造、克隆和融合表达.pdf

牛乳铁蛋白肽(bLFpep)的基因改造、克隆和融合表达摘要目·的:获得bLFpep的基因序列,依据bLFpep的结构特征及相关的文献报道,寻找合适的突变位点,并将bLFpep与突变体(Ml和M2)分别在大肠杆菌中克隆和融合表达,初步测定它们的抗菌活性。方法:根据bLFpep的氨基酸序列,应用大肠杆菌偏爱密码子,设计bLFpep的基因序列。并对bLFpep基因进行改造,将bLFpep基因序列中第10位Met密码子ATG用Trp密码子TGG来代替,得到突变体M1的基因序列;将bLFpep基因序列中第7、lO位的Gin、Met密码子CAG、ATG分别用Thr、、TGC来代替,得到突变体M2的基因序列。分别设计、合成两个DNA片段,通过连接反应得到两端有EcoRI和SalI酶切位点的二拷贝基因同向串联体。将bLFpep、bLFpep突变体M1和突变体M2基因二拷贝串联体分别与克隆载体pUCl8连接、转化大肠杆菌DH5a,经蓝白筛选,挑取阳性菌落,抽提重组质粒,酶切、PCR鉴定并测序。测序正确后将bLFpep、-1连接,转化大肠杆菌BL21,挑取菌落,抽提重组质粒,酶切、PCR鉴定并测序。将鉴定为阳性的菌落用IPTG37"C诱导表达4小时,。抽提全菌体蛋白,,然后用凝血酶和羟胺切割融合蛋白。最后用抑菌圈实验初步鉴定bLFpep、bLFpep突变体MI和突变体M2蛋白的抗真菌活性。结果:l、获得了bLFpep、bLFpep突变体M1和突变体M2基因二拷贝串联体。2、分别将bLFpep、bLFpep突变体M1和突变体M2基因二拷贝串联体克隆到载体pUCl8上,初步检测、筛选阳性转化子,并测序,结果表明与预先设计的bLFpep、bLFpep突变体Ml和突变体M2基因序列一致,突变体M1和M2达到预期突变效果,同时二拷贝基因重组质粒构建成功。13、-1与bLFpep、bLFpep突变体M1和突变体M2基因二拷贝串联体重组质粒,初步检测、筛选阳性转化子,进一步测序正确,可以进行诱导表达。4、-l后,经IPTG诱导表达4h,,说明二拷贝基因串联体得到融合表达。5、表达的融合蛋白经纯化,然后用凝血酶和羟胺对融合蛋自切割初步得到bLFpep、bLFPeP突变体M1和突变体M2蛋白。通过抑菌圈实验,64550的抑制活性。结论:成功获得了bLFpep、bLFpep突变体M1和突变体M2基因二拷贝同向串联体;并构建了bLFpep、bLFpep突变体M1和突变体M2二拷贝基因重组质粒;bLFpep、bLFpep突变体M1和突变体M2二拷贝基因的融合表达获得了成功,并初步得到bLFpep、bLFpep突变体M1和突变体M2蛋白。通过抑菌圈实验,初步检测出bLFpep和突变体M2蛋白对白色念珠菌的抑制活性。为进一步研究它们的抗真菌活性打下基础。关键词:牛乳铁蛋白肽;基因改造;二拷贝;基因克隆;融合表达GENEMoDIFICATIoN,CLoNINGANDEXPRESSIONOFBOVlNELACToFERRINPEPTIDEABSTRACTOBJECTIVE:ToobtainnormalbLFpep,andmakeamutalion,cloneandexpressboththenormalandthemutant似1andM2)geneinEcoli,:Accordingtothesequenceofbovinelactoferrinpeptide,,replacethe10mcodonforMetwithTrptoobtainthemutant(M1)inandMetwithThrandCystoobtainthemutant(M2).2repeatsofbovinelaetoferdnpeptideanditsmutant(MandM2)(MandM2)genewererespectivelyclonedintoEcoRIand勋,IsitesofpUC18cloningvector,transfor