蛇毒重组类凝血酶的分离纯化及亲和配基的制备.pdf

蛇毒重组粪凝血酶的分离纯化及亲和配基的制各摘要蛇毒中的类凝血酶属于丝氨酸蛋白水解酶,它的特点是能将血液中的纤维蛋白原转化为纤维蛋白凝胶。由于其形成的纤维蛋臼凝胶是非交联的,并极易为内皮系统或纤溶酶所降解,因此类凝血酶在I临床上可以用于降低血液中纤维蛋白原的水平、改善血液的流动性,从而达到防治和治疗衄栓类疾病的目的。在对蛇岛蝮蛇类凝血酶已有的研究基础上,本论文的工作从以下三个方面开展:(一)利用金属螯合层析纯化组合分离纯化重组蛇毒类凝血酶。我们将大连蛇岛蝮蛇毒类凝血酶基因连接到表达载体pET-32“+)上并转入大肠杆菌BL2l(DE3)中,在胞内获得可溶性表达。在表达产物的纯化过程中,比较了两种分离纯化方法的不同组合,重组类凝血酶经过组合一即金属螫合层析、疏水层析、Source15Q强阴离子交换层析纯化后纯度能达到88%,%,纯化倍数为26;而经过方案二中各步骤即金属螯合层析、DEAE弱阴离子交换层析、Source】5Q强阴离子交换层析纯化后,纯度只能达到75%,%,15。(二)本文设计合成了抗重组类凝血酶的鸡卵黄免疫球蛋白抗体(IgY)的亲和配基,考察了免疫亲和层析分离纯化重组蛇毒类凝血酶的效果。将通过免疫获得的鸡卵黄免疫球蛋白经过PEG一6000三步沉淀法粗提后,,再经过特异性免疫亲和柱纯化后,纯化倍数能达到200左右。表达产物的可溶组分经过疏水层析、免疫亲和层析、source15Q强阴离子交换层析三步纯化后,可获得纯度达到80%左右的目的融合蛋白,%,。(三)天然蛇毒中类凝血酶的分离纯化及酶学性质研究。采用sP阳离子交换层析、凝胶过滤、阴离子交换层析分离纯化蛇毒,得到两种有凝结活性的单一组分。酶I的分子量约为34kDa,×10‘4M,×10~mM/s:酶II的分子量约为38kDa,Km为57×104M,vmax为7,36×104mM,s。比较了五种不同的抑制剂的抑制效果,就酶I而言,4一氨基苯甲醚为最强的抑制剂,1蛇毒重组类凝m酶的分离纯化及亲和酉己基的制备雨盐酸胍为最弱抑制剂,而对于酶II,4一氨基苯甲醚为最强的抑制剂,盐酸胍为最弱抑制剂。关键词:类凝血酶,大肠杆菌,分离纯化,IgY,免疫亲和层析II垫耋重垫鲞墼堕堂塑坌塑丝垡丝薹塑墼萋笪型鱼thevalueofKmandVma)【were57×10。Mand736×10。4mM/parativeestimationoftheinhlbItoryemciencyofnVedi行erentinhibitortotwokiⅡdsofenzyme,f。renZymeI,4一aminobenzamⅫnewasthemosts仃onginhibitor,andguarIidinehydmchlo—cwasttlemostweakinhibitor,whichwerethesametoenZymeII,Keywords:thrombin—likeenzyme,Ej曲er缸矗曲co亿isol“onandpurification,IgY,immunoamnitychromatography蛇毒重组类凝血酶的分离纯化及亲和配基的制各0前言生物毒素亦称天然毒素,是指生物来源不可白复制的有毒化学物质,包括了各种动物、植物、微生物产生的对其他生物物种有毒害作用的化学物质。自有生物界以来,生物毒素就已经存在,人类对生物毒素的研究和利用也已有久远历史,但只是在近数十年M,爿急速发展成为一个新的重要交叉学科,即毒素学,并形成了生命科学中十分活跃的新领域,其研究发展对于农业、畜牧、医学、药物学、环境、灾害防治等多方面亦有重虹意义。生物毒索足‘类重要的生物资源,许多生物毒素市场售价极其昂贵,在国际上己逐渐形成一种高效益的技术产业,但其研究更积极的意义在于创新药物研究。生物毒素实质上就是具有特异活性和高选择性的天然活性物质,其中是很有价值的药物或药物导向化合物。据统计,目前临床应用的药物中约有1/3直接或间接来自生物毒素。随着经济与社会发展,人类对健康要求不断提高,严重影响健康的疾病也在不断变化,对新药要求与日俱增,而生物毒素正是受人瞩目的发现新药物的潜在领域,研究方式也由广泛筛选转向多层次深入研究。蛇毒中的类凝血酶是一种丝氨酸蛋白酶,属于胰蛋白酶家族,在体内能使纤维蛋白原转化成纤维蛋白,但一般不会激活凝血因子XIII,因而形成的纤维蛋白块不会进行交联而表现为不稳定状态,能很快被网状内皮系统吞噬和循环血液清除,引起血浆纤维蛋白原水平降低呈良性的去(脱)纤维蛋白状态,而表现抗凝效应。因此作为抗血栓药物在国内外均已引起重视并已在实际临床上得到应用。在本课