早期肺鳞癌相关蛋白的筛选及表达验证.pdf

郑州大学 2 0 0 8 届博士学位论文早期肺鳞癌相关蛋白的筛选及其表达验证早期肺鳞癌相关蛋白的筛选及其表达验证博士研究生: 燕贞导师: 吴逸明教授郑州大学公共卫生学院郑州 4 5 0 0 0 1 中文摘要近年来肺癌的发病率和死亡率呈明显上升趋势, 已成为对人类健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。早期诊断和治疗是防治肺癌、降低其死亡率的有效办法, 但由于肺癌临床症状隐匿, 导致早期诊断难度较大, 而解决这个难题的基础是寻找肺癌发生发展过程中有标志性意义的基因或蛋白, 即肺癌标志。分子生物学研究表明, 肺癌的发生、发展是一个多阶段、多步骤、多因素参与的过程, 涉及到大量相关基因及其蛋白质的异常变化。基因的功能是通过其表达的蛋白质来实现的, 因此肺癌可以被认为是一种蛋白质异常病。从蛋白质水平研究肺癌, 寻找高特异度和灵敏度的肺癌分子标志, 进而阐明其表达水平的变化与肺癌发生的关系, 对其早期诊断、普查和治疗具有重要的理论和实际意义。蛋白质组学方法己被广泛应用于寻找肿瘤相关蛋白的研究, 经典方法为比较蛋白质组学( C 。 m P a r a t i v e P r o t c o m i e s ) , 即比较肿瘤组织/ 细胞与对照组织/ 细胞表达的全部蛋白质, 筛选不同条件下的差异蛋白质。但由于肿瘤组织中既有实质也有间质, 间质的干扰导致实验结果可信度下降。血清学蛋白质组分析方法( S e re l o g i c p r o t e o m e a n a l ” 1 5 , S E R p A ) 是从体液免疫的角度, 采用双向电泳( t w o 一 d i m e n s i o n a l e l e e t r o p h o r e s i s , 2 一 D E ) 技术和免疫印迹技术相结合的一种新方法。由于肿瘤间质无显著特异性, 基本不会刺激机体产生抗体, 因此 S E R P A 可在一定程度上避免间质干扰造成的假阳性。但由于血清学检查的局限性, 利用血清中的抗体来筛选肿瘤相关蛋白, 存在敏感性及特异性变化较大的缺点。比较蛋白质组学方法和血清学蛋白质组分析方法联合应用可提高蛋白质组学方法的准确性和可靠性, 是寻找肿瘤相关蛋白较为理想的方法。既往蛋白质组学研究多以质谱鉴定的结果为结论, 但由于从 2 一 D E 到质谱分郑州大学 2 0 0 8 届博_ 1 : 学位论文早期肺鳞癌相关蛋白的筛选及其表达验证析整个技术流程长, 影响因素较多, 虽然筛选、鉴定出一些肺癌差异蛋白质, 但是对其表达情况和在疾病发生中的作用还有待进一步研究, 而且差异比较的重复性也需要各个层次的验证。故为了保证初筛鉴定结果的可信度及进一步研究的科学性, 对 2 一 D E 筛出的差异蛋白进行验证十分必要。寻找高特异度和高灵敏度的生物标志是肺癌早期诊断和治疗的重要方法, 然而, 目前的研究报道仍然存在着缺陷, 现有的肿瘤分子标志大多是针对中、晚期肿瘤的诊断, 因此不能真正降低肿瘤的发病率。而且肺癌的各种病理类型各有不同的发病机制, 单一病理类型的研究可能会更为准确。为了筛选、鉴定出早期肺鳞癌相关的蛋白质, 以 I 期肺鳞癌组织以及相应的癌旁正常肺组织、 I 期肺鳞癌患者血清和健康正常人血清为研究对象和材料, 联合应用比较蛋白质组学方法和血清学蛋白质组分析方法筛选早期肺鳞癌相关蛋白。本研究可丰富人类对肺组织蛋白质组的认识, 同时通过相应的鉴定和验证, 期望发现肺鳞癌中特异性的蛋白质, 为肺癌的早期诊断提供依据, 也将有助于进一步揭示肺癌发生发展的分子机制。研究目的 1 . 通过优化双向电泳及免疫印迹技术, 建立稳定的比较蛋白质组学和血清学蛋白质组技术平台, 结合基质辅助激光解吸/ 电离飞行时间质谱( M a t ri x 一 a s s i s t e d l a s e r d e s o 印 t i o 可 i o n i z a t i o n t i m e 一 o f - f i i g h t m a s s s p e c t r o m e t ry, M A L D I 一 T o F 一 M S ) 技术, 筛选和鉴定出早期肺鳞癌差异蛋白质。 2 . 通过实时荧光定量 p C R ( r e a l · t i m e q u a n t i t a t i v e p C R , R Q 一 P e R ) 、 W e s t e m B l o t 、免疫组织化学方法检测肺鳞癌差异蛋白在基因、蛋白水平的表达情况, 验证蛋白质组学方法筛选结果的可靠性和准确性, 并结合临床病理信息进行分析, 初步探讨其在肺鳞癌发生、发展中的表达变化。材料与方法 1 . 研究对象组织标本: 收集 2 2 例肺鳞癌患者的癌组织及相应的癌旁正常组织,