猴B病毒囊膜糖蛋白gD基因克隆表达及间接ELISA方法建立.pdf

中文摘要猴B病毒囊膜糖蛋白gD基因的克隆表达及间接ELISA方法的建立预防兽医学专业硕士研究生张文韬指导教师聂奎教授叶华虎副研究员中文摘要猴B病毒(Monl(ey BVirus)属于洳疱疹病毒亚科,单纯疱疹病毒属成员,是一种以猴(特别是猕猴属)为自然宿主的动物源性病原体。猴B病毒在其自然宿主中的感染率大于60%, 但多呈隐性感染。该病毒感染非自然宿主(人和其他动物)的致死性强,感染病例的病死率超过80%,即使幸存也会留下失语、瘫痪等严重的神经后遗症。流行病学调查显示,猴B病毒主要以接触感染为主,被感染猴抓伤、咬伤都有可能感染猴B病毒,也有人传人和虫媒传播等报道。灵长类的人和猴感染猴B病毒后,一旦出现IIi;i床表现,表明病毒已侵入神经系统,治疗便失去了意义。因此,建立快速鉴别诊断的方法,对猴B病毒早期的诊断与治疗有重要意义。由于猴B病毒与在脊椎动物(包括人类)中广泛感染的其他小疱疹病毒(特别是人单纯疱疹病毒,HSV)高度同源,表现出较强的交叉反应,因此,这类疱疹病毒成为了现阶段猴B 病毒快速鉴别诊断的土i要障碍。由于受HSV和猴B病毒的感染特点等因素影响,目前所建立的猴B病毒检测方法都达不到快速、特异之H的。临床医学中常用狒狒疱疹病毒4(Herpesvirus papio2,HVP-2)、猴因子8(simian agent8,SA8)和HSV等病毒蛋白作诊断抗原检测猴B 病毒,但其检测的灵敏度低。也有人研制了猴B病毒灭活疫苗,但该疫苗保护率低于50%。近年来,随着对猴B病毒结构研究的不断深入,特别是猴B病毒的全基因组测序的完成, 囊膜糖蛋白(glycoprotein)逐渐成为猴B病毒诊断和防治研究的书要靶点。,gD和gBl'l‘J抗体最先出现在急性或再发性人类HSV感染的血清中,并且达到很高效价,也可以保持2年之久。gB是导致灵长类疱疹病毒之间J-.泛抗原交叉反应的t要原凶,而gDOd的氨基酸序列相对保守,推断猴B病毒gD蛋白可以刺激机体产生特异性抗体。: (1)比较猴B病毒与HSV·1和HSV-2三种囊膜糖蛋白gB、gC和gD的I_J源性差异,分析猴西南大学硕士学位论文 B病毒囊膜糖蛋白gD基因序列; (2)从中国源恒河猴B病毒的感染组织中克隆gD胞外区基因,分析其序列特征:(3)对目的基因——猴B病毒gD基因进行原核表达: (4)以纯化后的重组gD蛋白为包被抗原,建立检测猴B病毒抗体的间接ELISA法。 、HSV-I和HSV-2 3种弘疱疹病毒中囊膜糖蛋白(gB、gC 丰qlgD)的I司源性差异,发现猴B病毒囊膜糖蛋白gB与HSVol、HSV-2的同源性为78%、77%, gC与HSV-1、HSV-2的同源性为42%、48%,gD与HSV-!、HSV-2的I一源性为56%、58%。有研究表f1)JgB是导致灵长类疱疹病毒之问广泛抗原交叉反应的主要原因,而gDqa的氨基酸序列却更加保守。本实验室研究人员前期获得了重组表达的猴B病毒囊膜糖蛋白gC并建立了 ,%和100%。因此,本试验以猴B 病毒囊膜糖蛋白gD作为研究对象。利用生物信息学方法对猴B病毒囊膜糖蛋I二lgD结构、亲水性、表面可及性、抗原性指数、柔韧性以及B细胞表位等参数进行分析和预测,结果显示:,,,;蛋白分子的柔性结构区域分布均匀,亲水性较好,表面可及性较高:区段24--44、49--60、49---76、107~1 18、141~150、164--174、206--214、287~308、 322~339希1365~、、、、、、、 、,提示B细胞抗原表位在这些区段的可能性较大。本试验最终选择猴B病毒囊膜糖蛋AgDI￥J胞外区作为筛选高效表达的抗原候选片段。 ,以猴B病毒囊膜糖蛋白gD基因胞外区为目的片段,,发现该序列存在包括Sinai、Sacll 等在内的203个常见酶,而Ndel、Hindlll等58个酶在该序列中未曾发现,最终选舭I、Hindlll 为酶切位点,设计特异性引物,PCR扩