膜联蛋白b2结构和功能的研究.pdf

膜联蛋白B2的结构与功能研究中文摘要膜联蛋白(annexin)家族是在真核生物中广泛存在,具有重要生理功能的一类钙依赖性磷脂结合蛋白。因其在Ca2+存在的情况下能够和酸性磷脂结合,所以又称为钙依赖性磷脂结合蛋白。膜联蛋白B2(AnxB2)是本实验室从猪囊尾蚴eDNA文库中筛选得到的一个新的膜联蛋白B家族成员。它具有四个典型的annexin重复结构域, 每个结构域包含一个“-(38residues).D/E”基序,形成4个type II型Ca2+结合位点;经生物信息学分析可知,AnxB2分子结构中包含15个抗原表位;AnxB2在II 和III结构域之间存在2个独特的“插入片段”和一个“(KGD)”序列并且AnxB2还具有一个独特的粘多糖附着位点()。我们根据AnxB2已有的结构特征来研究AnxB2的生物功能,为AnxB2功能的进一步研究奠定基础。本课题的研究分为三个方面: 1、从猪带绦虫六钩蚴中克隆出AnxB2基因,证明AnxB2在六钩蚴阶段表达。接着借助计算机同源模建技术构建了4个AnxB2突变体M234,M134,M124,M123。,并用阳离子脂质体介导的方法转染真核细胞,检测结果表明构建的真核质粒能够表达相应的目的蛋白;同时也构建了AnxB2突变体的原核表达载体并用亲和层析技术纯化相关蛋白。另外,;接着采用钙离子介导的沉淀反应来初步纯化重组蛋白:随后用离子交换层析技术进一步纯化蛋白。用改良的纯化方法,我们制备出高纯度和高生物活性的AnxB2。 2、对AnxB2进行免疫学方面的研究。将真核表达质粒分别免疫BALB/c纯系鼠, 以间接ELISA检测免疫小鼠血清的抗体应答水平;淋巴细胞增殖实验检测免疫动物 CD4+T细胞的活化状态:淋巴细胞细胞因子试验检测免疫小鼠的细胞免疫应答水平。结果表明,免疫注射的DNA疫苗虽然均能诱导Thl型免疫应答反应,但是它们诱导机体产生的免疫应答水平不同:-M234组诱导的抗体水平最低和 :“DNA boost'’组诱导的抗体水平和分泌的IFN叫水平最高。根据结果,我们可以推断:M234缺失的抗原表位为 B细胞表位,而M123缺失的表位是T细胞表位;“DNA ”策略可有效增强机体的特异性免疫应答。 3、对AnxB2进行抗凝血活性方面的研究。结果表明:AnxB2具有外源性抗凝血活性;与活化血小板结合的能力更强(versusAnxBl)。从结果我们可知,用改良的纯化方法制备的AnxB2保留了原来的生物活性,验证了这种纯化方法的可行性。随后第"-V-医大学硕士学位论文对AnxB2突变体M123、M234进行抗凝血活性和免疫原性研究。结果表明,M234 不仅较好的保留了野生型AnxB2的抗凝血活性,而且免疫原性降低,这为进一步研究膜联蛋白AnxB2的抗凝血功能和研制高效、低免疫原性的靶向溶栓剂奠定了基础。关键词:膜联蛋白B2,抗凝血活性,猪囊尾蚴,DNA疫苗,表达纯化,. 膜联蛋白B2的结构与功能研究 Abstract Annexins were alargefamily ofcalcium-dependent phospholipid-binding proteins widely distributed could reversibly bind toacidic phospholipid membranes inthepresence ofCaz+.Annexin B2(AnxB2)was anovel member ofthe annexin family ofCaz+-and phospholipid—binding proteins from Cysticercus contained fourtypical annexin repeats,each repeat posed of70—80amino acids and contained acanonicalmotif‘G?X GT(38 residues)一D/E’defined astype IICa2+ binding site. Bioinformatics analysis revealed thatAnxB2 contained 5antigenic determinants and AnxB2 al