16S rDNA鉴定细菌的方法.docx

16S rDNA鉴定细菌的方法.docx16SrDNA鉴定细菌的方法16SrDNA鉴定细菌的方法细菌16SrDNA鉴定主要分为7个部分:1•提取细菌基因组DNA,设计/选择引物进行PCR扩增,电泳检测纯度与人小。琼脂糖凝胶电泳分离胶冋收|=|的片段日的片段测序。BLAST比对获取相似片段。构建系统进化树试剂:L1培养基:通常选择组分简单且细菌生长良好的培养基(培养基组分过于复杂会影响DNA的提取效果,也可以在裂解细菌前用TE缓冲液对菌体进行洗涤。。IMTris-HCl(,,)(1L):,加浓盐酸约(70ml,60ml,42ml),高温高盐灭菌后,室温保存。冷却到室温后调pll,每升高1°C,。() (1L):・2H2O,用NaOH调pH至&0(约20g),高温高压灭菌,室温保存。10XTEBuffer(,,)(1L):组分:100mMTris-HCl,10mMEDTA。IMTris-HCl(,,)取100ml,()取20mlo高温高压灭菌,室温保存。1XTEBuffer用10XTEBuffer稀释10倍即可。10%SDS(W/V):称10g,68°C加热溶解,。室温保存。用之前在65°C溶解。配置时要戴口罩。6、 5MNaCl:,高温高压灭菌,4°C保存。7、 CTAB/NaCl(10%CTAB,):,加10gCTAB(十六烷基三甲基漠化镀),加热搅拌。用之前在65°C溶解。8、氯仿/异戊醉:按氯仿:异戊醉=24:1(V/V)的比例加入异戊醉。9、 酚/氯仿/异戊醇(25:24:1):按苯酚与氯仿/异戊醇二1:1的比例混合Tris-IICl平衡苯酚与氯仿/异戊醇。10、 TAE缓冲液:使用液IX:-乙酸,。浓储存液50X:242gTris,,()。11、 6X上样缓冲液(100ml):%混酚蓝(BPB),40%蔗糖,10mmol/LEDTA()(),4°C保存。12、 %琼脂糖凝胶:、 EB:10mg/mlo称取lg漠化乙锭定容至100mlo棕色瓶室温避光保存。(因EB是剧毒物质,H前很多实验室用生物荧光染料替代,常用的有Gelred等)14、 蛋白酶K:20mg/ml溶于水,-20°C保存,反应浓度50ug/ml,反应缓冲液:(),,5%SDS,反应温度:37-56°C。无需预处理。15、 RNaseA:10mg/mlo25mgRNaseA加IMTris()25ul,,无菌水2460ul,于100°C加热15分钟,缓慢冷却至室温,分装成小份保存于-2CTC。(为避免RNA的干扰,使用RNA酶降解基因组中的RNA。)1细菌基因组DNA提取基木步骤:基因组DNA提取所需仪器:高速冷冻离心机、恒温冰箱、移液器、水平电泳槽、紫外/荧光观测仪细菌基因组DNA提取方法综述细菌基因组DNA的提取方法主要冇5种。不同的方法所选择的试剂会有所不同。,12000rpm离心lmin,丢去上清夜,收集菌体。加入400ul裂解液(40mMTris-B酸,20mM醋酸钠,ImMEDTA,1%SDS,)混匀,置于o37C水浴lhr。然后加入200ul5mol/L的氯化钠溶液,混匀后于13000rpm离心15min。取上清液,用苯酚抽提2次,氯仿抽提1次。加两倍体积无水乙醇,1/10体积醋酸钾(3M,),-20度保存1小时后,IBOOOrpm离心15min,弃上清液,沉淀用70%乙酹洗2次;置于室温干燥后,溶于SOulTE溶液屮,置4°C保存备用。2蛋门酶/,用WashingTE(50mmo1/LTris-,lOmmol/LEDTApH8・0)洗菌体2次。将菌体充分悬浮在5ml1XTE缓冲液中,、%SDS,轻轻混匀后50°C放置3h-5ho用等体积的Tds饱和苯酚抽提2次,苯酚/氯仿/异戊酹抽提一次,氯仿抽提一次。乙醇