实验纤维素酶活力的测定.doc

实验纤维素酶活力的测定(3,5-二硝基水酸法)一、实验目的掌握还原糖的测定原理,学习用3,5-二硝基水酸法测定纤维素酶活力的法。 二、实验原理纤维素酶水解纤维素,产生纤维二糖、葡萄糖等还原糖,能将3,5-二硝基水酸中的硝基还原成橙黄色的氨基化合物,故可利用比色法测定其还原物生成量来表示纤维素酶的活力。三、主要仪器与试剂(一)(二)、,5-二硝基水酸显色液:,5-二硝基水酸,溶入200mL蒸馏水中,加入20g分析纯氢氧化钠,200g酒酸钾钠,加水至500mL,升温溶解后,,。加热搅拌,待全溶后冷却,定容至1000mL。存于棕色瓶中,放置一后使用。-乙酸钠缓冲溶液。%羧甲基纤维素钠水溶液,溶解后成胶状液,静置过夜。使用前摇匀。 :称取干燥至恒重的无水葡萄糖100mg,溶解后定容至100mL,。:,,待检测用。(-乙酸钠缓冲溶液配制)四、:,,,,,,均用蒸馏水稀释至1mL,-二硝基水酸显色剂3mL,在沸水浴中煮沸显色10min,冷却,加蒸馏水21mL,摇匀。以空白管调零,在550nm处比色。以光密度为纵坐标,以葡萄糖μg数为横坐标,绘出标准曲线。,5-,冷却后,加水定容,摇匀,:,沸水浴5min,%CMC-Na,与样品管同时放入50℃水浴30min。其它操作同样品管。:%,,于50℃水浴中糖化30min,取出,立即于沸水浴中煮沸10min使酶失活,得糖化液,,5-二硝基水酸显色液,再沸水浴10min,冷却后加水定容至25mL,混匀,以空白管调零,在550nm处测OD值,查葡萄糖标准曲线得样品的葡萄糖μg数。 五、结果计算在上述条件下,1㎎酶每分钟催化纤维素水解生成1微克葡萄糖定为一个活力单位。纤维素酶活力单位(μg/mg·min)=式中:N—酶液的稀释倍数,此处为10030—糖化所用时间,min1—反应酶液的mL数六、,都要去除葡萄糖外的其他各种成分的对OD值的影响。使得到的标准曲线经过坐标原点。,不能将移液管或移液枪头混用。各比色管中,均用蒸馏水稀释至1mL,-二硝基水酸显色剂3mL,在沸水浴中煮沸显色10min,冷却,加蒸馏水21mL,摇匀。,Learnthemethodofdeterminatingcellulaseactivityusing3,5-,5-pounds,(1)25mLcolorimetrictubetype(2).722spectrophotometer(3)dropper(4)bath(5)pipette(6)(1)3,5-dinitrosalicylicacidsolution:Weigh10g3,5-twonitrosalicylicacid,dissolvedin200mLofdistilledwater