PCR假阴性和假阳性.doc

PCR 假阴性和假阳性假阴性,不出现扩增条带 PCR 反应的关键环节有①模板核酸的制备,②引物的质量与特异性, ③酶的质量及, ④ PCR 循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。模板:①模板中含有杂蛋白质,②模板中含有 Taq 酶抑制剂,③模板中蛋白质没有消化除净,特别是染色体中的组蛋白, ④在提取制备模板时丢失过多,或吸入酚。⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时,不出现扩增带,极有可能是标本的消化处理,模板核酸提取过程出了毛病, 因而要配制有效而稳定的消化处理液, 其程序亦应固定不宜随意更改。酶失活: 需更换新酶, 或新旧两种酶同时使用, 以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加 Taq 酶或溴乙锭。引物: 引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称,是 PCR 失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题,两条引物一条浓度高,一条浓度低,造成低效率的不对称扩增,对策为: ①选定一个好的引物合成单位。②引物的浓度不仅要看 OD 值,更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳,一定要有引物条带出现, 而且两引物带的亮度应大体一致, 如一条引物有条带, 一条引物无条带,此时做 PCR 有可能失败,应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高,一条亮度低,在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存,防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分, 导致引物变质降解失效。④引物设计不合理, 如引物长度不够,引物之间形成二聚体等。 Mg2+ 浓度: Mg2+ 离子浓度对 PCR 扩增效率影响很大, 浓度过高可降低 PCR 扩增的特异性,浓度过低则影响 PCR 扩增产量甚至使 PCR 扩增失败而不出扩增条带。反应体积的改变:通常进行 PCR 扩增采用的体积为 20ul 、 30ul 、 50ul 。或 100ul ,应用多大体积进行 PCR 扩增,是根据科研和临床检测不同目的而设定, 在做小体积如 20ul 后, 再做大体积时, 一定要模索条件,否则容易失败。物理原因: 变性对 PCR 扩增来说相当重要, 如变性温度低, 变性时间短, 极有可能出现假阴性; 退火温度过低, 可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低 PCR 扩增效率。有时还有必要用标准的温度计,检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度,这也是 PCR 失败的原因之一。靶序列变异: 如靶序列发生突变或缺失, 影响引物与模板特异性结合,或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列,其 PCR 扩增是不会成功的。假阳性出现的 PCR 扩增条带与目的靶序列条带一致,有时其条带更整齐, 亮度更高。引物设计不合适:选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性,因而在进行 PCR 扩增时,扩增出的 PCR 产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短,容易出现假阳性。需重新设计引物。靶序列或扩增产物的交叉污染: 这种污染有两种原因: 一是整个基因组或大片段的交叉污染,导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决: ①操作时应小心轻柔,防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。②除酶及不能耐高温的物质外,所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。③必要时, 在加标本前,反应管和试剂用紫外线照射,以破坏存在的核酸。二是空