水霉拮抗菌株的筛选与作用效果的研究.pdf

上海海洋大学
硕士学位论文
水霉拮抗菌株的筛选与作用效果研究
姓名:张书俊
申请学位级别:硕士
专业:临床兽医学
指导教师:杨先乐
20080515
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愕丶锤籽簦;采用人工攻毒感染异育银鲫实验表明,异育银鲫感染后抑菌圈直径为衄,培养后的抑菌圈直径为,而阳性对照中,真菌药水霉拮抗菌株的筛选与作用效果研究摘要为了获得筛选用指示菌株——水霉病致病菌株,从感染水霉病的史氏鲟肌肉组织分离获得一株水霉菌株Ⅺ溆味咦邮头欧绞轿K故舴绞剑ü缇Ⅺ荒懿行越峁埂8菡庑┬翁卣骺山á鉴定为寄生水霉为了获得水霉病病原的拮抗微生物,以水霉ⅪV甘静≡云滢卓水霉病为淡水养殖的常见病害,给水产养殖业造成了巨大的经济损失。孔雀石绿在全球范围内的禁用,更加剧了水霉病的危害。然而抗生素类药物在水产上易引起耐药菌株的产生、药物残留等问题。生态防治是一个行之有效的途径,能够控制病原菌的数量,减少疾病的发生,同时还能改善养殖环境,维护微生态平衡。本着为水霉病生态防治益生菌开发提供候选菌株的目的,对水霉拮抗菌株进行了筛选,并对其益生效果进行了评价。观察第二孢孢子,表面有长的带钩的毛纹饰,且第二孢孢子呈现间接萌发方式,出现了水霉典型白毛症状,〉闹虏【株。同时人工感染异育银鲫水霉病方法为研究拮抗菌对水霉病的防治效果提供了技术保障。菌进行了筛选。结果表明,从不同地区的养殖环境中共分离得到了晗妇其中对水霉表现出抑制作用的有辏芡耆种扑股さ挠辍Mü定菌株溶血素的产生、培养天后对水霉菌丝生长抑制作用、菌体对水霉孢子萌发生长抑制作用、无细胞发酵滤液拮抗活性,对株拮抗菌株进行了复筛,、在各方面的拮抗活性最为突出,且无溶血素产生。选择菌株,研究了菌体、无细胞发酵液的体外拮抗活性,并对无细胞发酵液的拮抗活性产生原因进行了分析,研究了产生的拮抗物质的稳定性。结果显示,平板抑制实验中,能够显著抑制水霉菌丝生长及孢子萌发。菌落周围形成清晰的抑菌圈,且抑制作用大小与培养时间有关,培养后产生的敏纸片咪康唑毗对水霉形成的抑菌圈直径为,兹甘形成的抑菌圈直径为。距离为的菌线间,孢子的萌发完全受到抑上海海洋大学硕士学位论文
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采用灯妇远ㄏ低臣∕J人グ彳蔇肛口咖妇阝牖蛐蛄校治隽讼喙叵制。无细胞发酵液实验表明,琼脂扩散法实验中,无细胞发酵液对水霉菌著抑制水霉菌丝生长及孢子萌发。无细胞发酵液原液及段蘧∈鸵耗芄完全抑制水霉菌丝生长及孢子萌发,与对照相比,丁断∈臀蘧⒔⒙氏啾龋倍、⒑蟮木可ひ彩艿揭种疲倍稀释组中萌发后的菌丝在整个实验过程中均未形成网状,倍稀释组中的萌发后的菌丝在实验最后阶段形成网状,而对照组中萌发形成的菌丝则在实验后的本统氏滞戳恕水霉在为的禾迮嘌芯苌ぃ鳰尴赴⒔鸵旱膒为矣肂液体培养基稀释逗蟮腗尴赴⒔鸵和芡耆种扑霉菌丝生长,结果表明产生拮抗作用不是因为值的改变及营养竞争,而是产生了具有拮抗活性的物质。采用二氯甲烷、乙醚两种有机溶剂不能从无细胞培养基中的浓度低于/保倍无菌水稀释液能完全抑制水霉菌丝生长:而当浓度为陬疞时,与诹疞浓度组相比,段蘧稀释液对菌丝生长抑制率下降了%,而倍稀释组抑制率则分别下降了.%、.ァM毖芯苛薓哪榭刮镏实奈榷ㄐ裕峁砻鳎琈尴赴酵液对温度不敏感;对较不敏感;对蛋白酶舾校鞍酌缸饔煤蠖云滢卓活性有影响。以此可以推断,无细胞发酵液中拮抗活性成份为蛋白性质的。无细胞发酵液经过截留分子量为某斯艹撕舐艘旱霓卓够钚悦挥懈变,可以推出其拮抗活性物质的分子量低于。为了评价菌株的应用效果,及为将作为益生菌开发的候选菌株提供理论参考依据,研究了对人工感染异育银鲫水霉病的防治效果。结果表明,预防实验中,能够有效预防水霉病的发生,降低了异育银鲫的死亡率,%,随着时间的推迟,死亡率逐渐增大,至实验结束时死亡率达到了%。为了进一步确定的分类学地位,测定了其上海海洋大学硕士学位论文丝生长没有抑制作用;孔板法实验中,与对照组相比,无细胞发酵液能够显著延缓了水霉菌丝的生长,当对照组中的菌丝铺满整个孔径时,丁断∈无细胞发酵液组中水霉的菌丝长度分别为和;对孢子而言,与对照发酵液中提取出有拮抗活性的物质;采用硫酸铵沉淀法也不能使拮抗活性物质从无细胞发酵液中有效分离出来。对产生拮抗物质量有一定的影响,当
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菌相应序列的同源性,构建了系统发生树,结果表明与彳量趕缈矗抛砷池鲫亲缘关系最近,因此将鉴定必嗜水气单稳蔼淳现薇谅对异育银鲫、中华绒鳌蟹没有致病性,是安全的。为了在规模化生产中提高№鹾,生长最适溢度为℃~℃,最适州值为。罴焉さ奶肌⒌