实验10双缩脲法测定蛋白质含量.ppt

实验十 双缩脲法测定蛋白质浓度
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一、实验目的
1. 学习常见蛋白质含量测定的原理和方法
2. 掌握双缩脲法测定蛋白质含量的方法
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二、原理
一、分光光度法的基本原理及方法
（一）利用吸收光谱对物质进行定性分析
维生素B12溶液的吸收光谱
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主要方法：
（1）比较吸收光谱曲线
（2）比较最大吸收波长
蛋白质的最大吸收波长为280nm；
核酸的最大吸收波长为260nm。
（3）比较吸光度的比值
纯DNA：
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（二）利用吸收光谱对物质进行定量分析
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1．原理
Beer-Lambert（比尔）定律：
T=I/I0
A=lg1/T=lgI0/I
A=εcl
其中：T为透光率；A为吸光率；I0为入射光强度；I为透射光强度；
ε为摩尔消光系数；C为溶液浓度；L为溶液光程的厚度
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2．常用方法
（1）标准曲线法
　　　　　　　　　　　　　　　　　
标准曲线与样品的测定条件必须一致。
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（2）标准管法
CX/AX=CS/AS，已知CS，测定AS、AX可求得CX。
（3）摩尔吸光系数法
C=A/（为L=1cm，C为1 mol/L时的吸光系数，也称为摩尔吸光系数。
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微量凯氏定氮法测定蛋白质总含量
被测的天然含氮化合物与浓硫酸共热时分解出氨，氨与硫酸反应生成硫酸铵。在凯氏定氮仪中加入强碱碱化消化液，使硫酸铵分解出氨。用水蒸汽蒸馏法将氨蒸入无机酸溶液中，然后再用标准酸溶液进行滴定，滴定所用无机酸的量(mol)相当于被测样品中氨的量（mol），根据所测得的氨量即可计算样品的含氮量。
因为蛋白质含氮量通常在16 %左右，，便得到该样品的蛋白质含量。
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Folin-酚试剂法(Lowry法)测定蛋白质浓度
蛋白质含有两个以上的肽键(—CO—NH—)，因此有双缩脲反应，在碱性溶液中，能与Cu2+形成络合物。Folin酚反应是在双缩脲反应的基础上，引进Folin试剂(磷钼酸—磷钨酸试剂)，蛋白质—铜络合物能还原磷钼酸—磷钨酸试剂，生成蓝色物质。在一定条件下，蓝色强度与蛋白质的量成正比例。本法的优点是操作简便、灵敏度高、较紫外吸收法灵敏10—20倍，较双缩脲法灵敏100倍。其不足之处是此反应受多种因素干扰。（Tris缓冲剂、蔗糖、硫酸铵、巯基化合物、酚、柠檬酸）。
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