实验10双缩脲法测定蛋白质含量.ppt

实验10双缩脲法测定蛋白质含量
一、实验目的
1. 学习常见蛋白质含量测定的原理和方法
2. 掌握双缩脲法测定蛋白质含量的方法
二、原理
一、分光光度法的基本原理及方法
（一）利用吸收光谱对物质进行定性分析
维生素B12溶液实验10双缩脲法测定蛋白质含量
一、实验目的
1. 学习常见蛋白质含量测定的原理和方法
2. 掌握双缩脲法测定蛋白质含量的方法
二、原理
一、分光光度法的基本原理及方法
（一）利用吸收光谱对物质进行定性分析
维生素B12溶液的吸收光谱
主要方法：
（1）比较吸收光谱曲线
（2）比较最大吸收波长
蛋白质的最大吸收波长为280nm；
核酸的最大吸收波长为260nm。
（3）比较吸光度的比值
纯DNA：
（二）利用吸收光谱对物质进行定量分析
1．原理
Beer-Lambert（比尔）定律：
T=I/I0
A=lg1/T=lgI0/I
A=εcl
其中：T为透光率；A为吸光率；I0为入射光强度；I为透射光强度；
ε为摩尔消光系数；C为溶液浓度；L为溶液光程的厚度
2．常用方法
（1）标准曲线法
　　　　　　　　　　　　　　　　　
标准曲线与样品的测定条件必须一致。
（2）标准管法
CX/AX=CS/AS，已知CS，测定AS、AX可求得CX。
（3）摩尔吸光系数法
C=A/（为L=1cm，C为1 mol/L时的吸光系数，也称为摩尔吸光系数。
微量凯氏定氮法测定蛋白质总含量
被测的天然含氮化合物与浓硫酸共热时分解出氨，氨与硫酸反应生成硫酸铵。在凯氏定氮仪中加入强碱碱化消化液，使硫酸铵分解出氨。用水蒸汽蒸馏法将氨蒸入无机酸溶液中，然后再用标准酸溶液进行滴定，滴定所用无机酸的量(mol)相当于被测样品中氨的量（mol），根据所测得的氨量即可计算样品的含氮量。
因为蛋白质含氮量通常在16 %左右，，便得到该样品的蛋白质含量。
Coomassie Dye-Based 蛋白质定量
PROTEIN
+
Amax = 595nm
BLUE
Acid
Coomassie G-250
Protein - Dye
Complex
O
CH
2
CH
3
NH
C
CH
3
CH
3
N
CH
2
SO
3
-
CH
3
CH
2
N
CH
2
CH
2
CH
3
SO
3
Na
+
双缩脲法测定蛋白质*
双缩脲反应：双缩脲在碱性条件下与铜离子结合生成紫红色化合物，颜色深浅与蛋白质浓度成正比。本法测定蛋白质范围1-10mg
H2N-CO-NH2 + NH2-CO-NH2 H2N-CO-NH-CO-NH2 ＋NH3
双缩脲
三、操作步骤
，按下表编号、加试剂
，,37oC反应30min。
，测定各管540nm光吸收值。
四、结果处理

以牛血清白蛋白含量为横坐标，OD540为纵坐标，绘制标准曲线。

根据样品的OD540从标准曲线上查得样品的蛋白质含量（mg/mL），再根据样品的体积算出样品的浓度。
五、注意事项
1. 须于显色后30min内测定，且各管由显色到比色时间应尽可能一致。
2.*样品蛋白质含量应在标准曲线范围内。
3. 比色杯的使用
微量表达法
10-3 (g, m, L) milligram 毫（克） mg
10-6 microgram 微（克） g
10-9 nanogram 纳（克） ng
10-12 picogram 皮 （克） pg
10-15 femtogram 飞（克） fg
10-18 attogram