植物病原线虫的分离方法及形态观察实验.doc

植物病原线虫的分离
一、目的要求
了解从土壤与植物组织中分离线虫的基本原理,掌握从土壤与植物组织中分离线虫的常用方法。学习在解剖镜或扩大镜下用镊子、竹针、毛针、毛笔等工具从水中与滤纸上挑取线虫的方法。
二、基本原理
植物寄生线虫主要存在于土壤与植物组织中,分离线虫的方法有许多,要根据线虫的种类、研究目的等来选择适宜的方法。植物寄生线虫的个体很小,除极少数可从植物组织中直接挑出以外,绝大多数需借助特定的工具与方法才能完成。线虫的分离主要就是利用它的趋水性、大小、比重以及与其她杂质的差异,采用过筛、离心、漂浮等措施,将线虫从植物组织、土壤中分离出来。
三、材料、试剂与仪器
感染根结线虫病的植物病根、病土、感染大豆孢囊线虫或其它孢囊线虫的病土、感染甘薯茎线虫的病薯块等。
解剖镜、漏斗分离装置、漂浮分离装置、浅盘分离装置、纱布或铜纱、记数皿或平皿、小烧杯、小玻管、旋盖玻璃瓶、40目与325目网筛、线虫滤纸、餐巾纸、挑针、竹针、毛针、毛笔等。
线虫固定液。
四、实验操作

对于个体较大的线虫如根结线虫、孢囊线虫、粒线虫的雌虫等,可直接用挑针从植物组织中挑取,也可在解剖镜或扩大镜观察下直接挑取,对于虫体稍小的线虫如茎线虫、粒线虫的雄虫与幼虫等,需在解剖镜下,用竹针或毛针直接挑取。
取感染根结线虫的植物病根材料(若就是干材料需用水浸泡过夜),剥开皮层,观察里面就是否有针头大小、乳白色发亮的颗粒状物。用挑针挑取,置凹玻片上水滴中,在解剖镜或显微镜下观察就是否为根结线虫雌虫。

该方法操作简单,就是目前从植物材料中分离线虫较好的方法。其装置就是将直径10~ 15cm 的玻璃漏斗架在铁架上,下面接一段约 10 cm 的橡皮管,橡皮管上装一个弹簧夹。
(1)将植物材料切碎用双层纱布包好,浸在盛满清水的漏斗中,或在漏斗内衬放一个用细铜纱制成的漏斗状网筛,将植物材料直接放在网筛中,分离土壤线虫时需在网筛上放一层纱布或多孔疏松的纸,上面加一层土样。
(2)加水,静止24h。
提示 由于趋水性与自身的重量,线虫就离开植物组织或土壤,沉降到漏斗底部的橡皮管中。
(3)打开弹簧夹,慢慢放出底部约5 ml水样于平皿内。
(4)在解剖镜下观察分离到的线虫。若线虫数量太少,可将水样倒入离心管中,在1500rpm离心机中离心3 min,倒掉上层清水,将下层沉淀物悬浮后倒入平皿或记数皿中,在解剖镜下观察记数,然后将线虫用毛针或毛笔挑入盛有固定液的小玻璃管中备用。
提示 该方法也可用于分离土壤中的线虫,尤其就是分离较为活跃的线虫。

对于用漏斗分离法不易分离到的线虫,如根结线虫与孢囊线虫的雄性成虫等,可采用培育分离法。
将病根采回后洗去表面土粒,放在培养皿中湿润的滤纸上培育3d,用少量清水冲洗组织与皿底,检查水中线虫。或将组织放在有螺旋盖的玻瓶中,加入几毫升清水,盖不要旋紧,在室温(20~ 25℃ )下培育3d,然后加50 ml清水,盖紧盖子并轻轻振荡,后倒出悬浮液使其顺序通过40目与325目网筛,用小水流轻轻冲洗325目网筛背面,收集到记数皿或烧杯中,直接检查或离心后检查。
提示 从土壤中得到病根后要马上冲洗与培育,因为2