细胞生长状况有关指标的检测方法.doc

细胞生长状况有关指标的检测方法一、细胞计数这是细胞培养中常用的基本技术之一。所用材料为细胞计数板。巴氏吸管和显微镜。步骤如下。 l 取清洁计数板和专用盖玻片,用丝绸布轻轻擦干。 l 取细胞悬液 , 加入 结晶紫染液, 混匀后滴半滴于细胞计数板内, 以充满不外溢为宜。也可直接将细胞悬液在一侧滴加到盖玻片中, 不要溢出, 也不要过少或出现气泡。 l 在显微镜下用 10X 物镜观察计数四角大方格中的细胞数。代入下式得出细胞密度。细胞数( ml)=(4 大格细胞数之和/4)× 104 × 稀释倍数台盼蓝染色法可计算出活细胞和死细胞数以测定细胞存活百分率。一般 %-% 的台盼蓝染液可使死细胞染成蓝色,活细胞不着色。此外还可用 % 的藻红 b 染液将死细胞或受损细胞染成红色,或用 % 的苯胺黑染液将死细胞染成黑丝。细胞存活率=[4 大格活细胞数/(4 大格活细胞数+4 大格死细胞数) ]× 100% 在进行细胞计数操作时,必须把细胞悬液准备好,细胞应分散良好,并充分混匀, 若出现较多细胞团或细胞数少于 200 个/10mm2 或多于 500 个/100mm2 时,需重制细胞悬液,重新计数。二、细胞生长曲线和生长倍数细胞生长曲线是细胞培养实验中最基本的指标, 是测定细胞绝对增值数值和生长繁殖基本规律常用的简便方法。常用的方法为: 在同一规格的培养瓶中, 接种等量的同一代细胞, 经培养后每隔 24h 取出几瓶细胞进行计数, 以培养时间为横坐标, 不同时刻的细胞数的对数为纵坐标,标出各点并连成线,即为该细胞的生长曲线,可反映出细胞生长的动态。测定生长曲线的另一种方法是用 96孔/24 孔细胞培养板,分7组, 每组 3孔, 培养 1周(7天) ,期间逐日检测一组,计数,最后把 7 天中的细胞数值绘成图,即为细胞生长曲线。也可采用 MTT 法来进行生长曲线测定。标准的细胞生长曲线近似“S”形,一般在传代后第一天细胞数有所减少,经过一段时间的潜伏期,再进入对数生长期,达到平台期后生长稳定,最后衰老。细胞生长倍数是指测定接种时活细胞的浓度,经 1 个生长周期达到最大活细胞浓度比例。生长倍数= 培养后最大活细胞数浓度/ 接种时的活细胞浓度三、细胞分裂指数细胞分裂指数是表示细胞增殖旺盛程度的指标。它以被测的 1000 个细胞中的分裂细胞数来计算。其方法为:用秋水仙素将细胞处理 1-2h 后,玩染色制片法制片并染色,计算 1000 个细胞中分裂象的数目,重复 4 次取平均值,用百分比表示。 l 细胞准备。用支持物盖片培养法。 l每 24h 取出一个小盖片,按常规方法进行固定,吉姆萨染色或 HE 染色, 封片,制成永久标本。 l 显微镜下选择细胞密度适中的区域观察分裂细胞并计数。逐个视野进行, 对每一时间组的盖片各取细胞多、中、少的区域各一个, 共计算 1000 个细胞, 计算出平均分裂细胞所占百分比。观察时要掌握好分裂象标准, 主要是确定好划分间期和前期, 末期和间期等的界限,以减少误差。细胞分裂指数= 分裂细胞数/ 细胞总数( 1000 )× 1000 [next] 四、细胞接种存活率细胞接种存活率又称细胞贴壁率。它是下拨被制成分散的悬液后,以低浓度( 2-5 个/cm2 ) 接种到底物上, 贴壁并能存活生长形成细胞小群( 克隆)