凯基TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒.doc

凯基TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒.doc凯基TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒
凯基TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒(通用)
（BIOTIN标记POD法,适用于细胞、组织样本）
使用说明书
一、TUNEL制品说明
凯基TUNEL细胞凋亡检测试剂盒是用来检测细胞在凋亡过程中细胞核DNA的断裂情况，其原理是生物素（biotin）标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）的作用下,可以连接到凋亡细胞中断裂的DNA的3‘－OH末端，并可与连接了的辣根过氧化酶的链霉亲和素（Streptavidin-HRP）特异结合，在辣根过氧化酶底物二氨基联苯胺（DAB）的存在下，产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在普通显微镜下即可观察和计数凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被染色。
本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）的凋亡原位检测。
本试剂盒特点
● 操作简便：使用Ready-to-Use型试剂，并配有Proteinase K 和DAB。
● 高灵敏度：可以单一检出初期的凋亡细胞。
● 高特异性：能特异性染色凋亡细胞。
● 快速操作：整体操作约需3小时。
● 用途广泛：可应用于组织切片、细胞样本等。
● 方便观察：使用光学显微镜观察实验结果。
● 高正确性：有阳性对照片的制备方法，可以确认试剂盒的有效性
使用注意事项
1．使用前请认真阅读本说明书，提前准备好相关试剂。
2． 因本试剂盒中组分均为微量，使用前请离心集液。
3． 为避免试验误差、降低试剂的损耗，建议使用精密度高的进口微量移液枪及枪头。
4． TdT 酶反应液最好在使用前根椐样本数量集中配制，再分别滴加于各样本片上，避免每个样本单独配制而产生的试剂损耗。
5. 为防止样本脱落，请使用硅烷（Silane）处理的载玻片或采用多聚赖氨酸铺片。
6. 固定好的样本可以在-20℃的70%乙醇中放置30分钟或至过夜，以改善细胞的渗透性。
7. 使用PBS清洗细胞样本时，不要直接加在细胞样本上，以防止细胞样本的脱落。
8. 进行PBS清洗时，以5分钟清洗3次为标准。
9. DAB为固体粉末，使用前加入PBS配制成20×DAB（10 mg/ml）后，按说明书显色使用。
二、TUNEL试剂盒组分
组 份
Cat: KGA702
20 assays
Cat: KGA703
50 assays
Cat: KGA704
100 assays
储存条件
Equilibration Buffer
mL
mL
mL
-20℃
Biotin-11-dUTP
20μL
50μL
100μL
-20℃
TdT Enzyme
80μL
200μL
400μL
-20℃
50×Proteinase K
40μL
100μL
200μL
-20℃
Streptavidin-HRP
10μL
25μL
50μL
4℃避光
DAB
2mg
5mg
10 mg
-20℃
试剂盒以外自备仪器和试剂
光学显微镜、37℃孵箱、微量移液器、染色湿盒、盖玻片、载玻片、染色缸。
二甲苯、多聚甲醛、PBS、H2O2 、TritonX-100、柠檬酸钠、复染染液：苏木素或甲基绿等。
三、操作流程概览
细胞涂片、贴壁细胞爬片等细胞样本
固定
样本通透性的促进
TdT酶的作用下Biotin-dUTP与样本DNAD的标记反应
加入Strep tavidin-HRP及底物DAB的显色反应
光学显微镜观察

四、检测样本的预处理
TUNEL检测时样本的预处理是试验的关键所在，本说明书推荐的条件仅为普遍情况，用户需根椐自已的样本材料及首次试验结果来调整各个条件（参照Page 9），如处理时间、处理浓度等，来优化出适合自身样本的试验条件，从而做出客观的试验结果。
1． 细胞样本的准备

操作注意事项：
1. 为防止样本脱落，请使用硅烷（Silane）处理的载玻片或采用多聚赖氨酸铺片。
2. 使用PBS清洗细胞样本时，不要直接加在细胞样本上，以防止细胞样本的脱落。
3. 进行PBS清洗时，以5分钟清洗3次为标准。
4. 固定液、PBS、封闭液、通透液、染色缸需用户自备，请按上述方法配制。
五、 标记和显色反应
操作注意事项：
1. 进行PBS清洗时，以5分钟清洗3次为标准。
2. PBS清洗后，为了各种反应的有效进行，请尽量除去PBS溶液后