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primer5 和 Oligo 的引物设计、使用方法
吴乃虎的《基因工程原理》
一、引物设计 step by step
、在 NCBI 上搜索到目的基因，找到该基因的 mRNA ，在 CDS 选项中，找到编码区所在位置，在 下面的 origin 中， Copy 该编码序列作为软件查询序列的候选对象。
、用 Primer Premier5 搜索引物
打开 Primer Premier5 ，点击 File-New-DNA sequence, 出现输入序列窗口， Copy 目的序列 在输入框内（选择 As ），此窗口内，序列也可以直接翻译成蛋白。点击 Primer ，进入引物窗口。
此窗口可以链接到 “引物搜索 ”、“引物编辑”以及“搜索结果 ”选项，点击 Search 按钮，进入引物搜 索框，选择 “PCR primers ”， “Pairs ”，设定搜索区域和引物长度和产物长度。在 Search Parameters
里面，可以设定相应参数。一般若无特殊需要，参数选择默认即可，但产物长度可以适当变化， 因为100 - 200bp的产物电泳跑得较散，所以可以选择 300〜500bp.
点击 OK ，软件即开始自动搜索引物，搜索完成后，会自动跳出结果窗口，搜索结果默认按照评分 （Rating ）排序，点击其中任一个搜索结果，可以在 “引物窗口 ”中，显示出该引物的综合情况，包括上游 引物和下游引物的序列和位置，引物的各种信息等。
对于引物的序列，可以简单查看一下，避免出现下列情况： 3'不要出现连续的3个碱基相连的情
况，比如GGG或CCC，否则容易引起错配。此窗口中需要着重查看的包括： Tm应该在55〜70度之间,
GC %应该在45 %〜55 %间，上游引物和下游引物的 Tm值最好不要相差太多，大概在 2度以下较好。该
窗口的最下面列出了两条引物的二级结构信息，包括，发卡，二聚体，引物间交叉二聚体和错误引发位置。 若按钮显示为红色，表示存在该二级结构，点击该红色按钮，即可看到相应二级结构位置图示。最理想的
引物，应该都不存在这些二级结构，即这几个按钮都显示为 “None为好。但有时很难找到各个条件都满足
的引物，所以要求可以适当放宽，比如引物存在错配的话，可以就具体情况考察该错配的效率如何，是否 会明显影响产物。对于引物具体详细的评价需要借助于
Oligo 来完成， Oligo 自身虽然带有引物搜索功能， 但其搜索出的引物质量感觉不如 Primer5.
在 Primer5 窗口中，若觉得某一对引物合适，可以在搜索结果窗口中，点击该引物，然后在菜单 栏，选择 File-Print-Current pair ，使用 PDF 虚拟打印机，即可转换为 Pdf 文档，里面有该引物的详细 信息。
、用 Oligo 验证评估引物
在 Oligo 软件界面， File 菜单下，选择 Open ，定位到目的 cDNA 序列（在 primer 中，该序列已 经被保存为 Seq 文件），会跳出来两个窗口，分别为 Internal Stability （ Delta G ）窗口和 Tm 窗口。 在 Tm 窗口中，点击最左下角的按钮，会出来引物定位对话框，输入候选的上游引物序列位置（ Primer5 已经给出）即可，而引物长度可以通过点