丙型肝炎病毒核酸定量测定试剂盒说明书范文.docx

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丙型肝炎病毒核酸定量测定试剂盒（ PCR-荧光法）
说明书
【产品名称】
通用名：丙型肝炎病毒核酸定量测定试剂盒（ PCR-荧光法）
英文名：PCR-FluorescenceDete
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取与步骤

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1相同数量的离心管，各加入

200ul

异丙醇（

-20℃预冷），作好标记。吸
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取步骤

3各管中的上清转移至相应的管中（在尽量吸尽上清的同时注意不要吸取中间层）

，颠倒混匀。
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13000rpm离心

10min（注意固定离心管方向）。
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轻轻倒去上清或用吸头吸干液体，加入

500ul75%乙醇，颠倒洗涤。
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13000rpm离心5min（注意固定离心管方向），轻轻倒去上清或用吸头吸干液体。
7500rpm离心5sec（注意固定离心管方向），用吸头尽量吸干被甩至管底的残余液
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体（一份样本换一个吸头，注意吸头不要碰到有沉淀的一面）

，室温干燥

1-5min（干燥时间随残余液体的吸干程度而不同，以沉淀表面无肉眼可见水珠为准；不宜过分干燥，以
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免RNA不溶）。
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各加入

10ulDEPC水，轻轻混匀，溶解管壁上的

RNA，稍微离心，冰上保存备用
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（请在

2小时内用于

PCR扩增），暂时不用时保存于

-20℃，时间不应超过

3天。
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2. 扩增试剂准备（

PCR前准备期）
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从试剂盒中取出 RT-PCR主反应液、酶混合液和荧光探针，在室温下融化并振荡混匀简短离心。
每个测试反应体系配制如下：
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试剂

RT-PCR主反应液

酶混合液

荧光探针
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用量（ul）

29
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计算好各试剂使用量，加入一适当体积离心管中，充分混匀，简短离心，向设定的

n个（n=样本数+1管强阳性对照

+1管临界阳性对照

+1管阴性对照

+4个校准品）

PCR反应
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管中分别加入 30ul，转移至样本处理区。
加样（样本处理区）
（1-4）各10ul，盖紧管盖，简短离心，将反应管放入荧光PCR检测仪中，记录样本摆放顺序。
RT-PCR反应（检测区）：
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步骤
循环数
温度(℃)
反应时间(min:sec)
1
1
42
30:00
2
1
95
3:00
3
5
95
10
55
30
72
1:00
4
40
95
5
60
30
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荧光信号的收集定为 FAM，数据的采集定在 60℃。
【结果分析】
结果分析条件设定:
使用ABIPRISM7000荧光PCR检测仪进行结果分析时基线（ baseline）取6-10或6-15个循环的荧光信号；阈值（ threshold ）设定原则以基线刚好超过阴性对照品扩增曲
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线的最高点，且

Ct值=40为准。定量标准曲线的相关系数应达以上。
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2. 质控标准
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本试剂盒的定量线性范围：

103≤测定结果≤

108IU/ml

。
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将校准品

1-4

的浓度输入，仪器自动以定量质控参考品的拷贝数的对数值为横坐标，以其实际测得的

Ct值为纵坐标给出标准曲线，标准曲线的相关系数应≥，否则实验无效。
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