多克隆抗体的制备方法1.docx

抗体的制备方法与原理
一、抗血清的制备
有了质量好的抗原，还必须选择适当的免疫途径，才能产生质量好（特异性强和效价高）的抗体。
一）用于免疫的动物
如一般制备抗r-免疫球
作免疫用的动物有哺乳类和禽类，主要为羊、马
佐剂可以直接或间接激活免疫活性细胞并使之增生，从而增强了体液免疫、细胞免疫和非特异
性免疫功能；
良好的佐剂应具有无毒性或副作用低的特点。
常用佐剂的种类和制备
佐剂主要可分为两种：一种本身具有免疫原性，如百日咳杆菌、抗酸杆菌（结核分枝杆菌）以及革兰阴 性杆菌等；另一种本身无免疫原性，如氢氧化铝、磷酸钙、矿物油乳剂、表面活性剂等。目前应用最多的是 弗氏佐剂 (Freund adjuvant) 。
1． 弗氏佐剂
弗氏佐剂是目前动物实验中最常用的佐剂， 分为不完全弗氏佐剂和完全弗氏佐剂。 不完全弗氏佐剂是液
弗氏佐剂是目前动物实验中最常用的佐剂， 分为不完全弗氏佐剂和完全弗氏佐剂。 不完全弗氏佐剂是液
体石蜡与羊毛脂混合而成，组分比为 1〜5 : 1，可根据需要而定，通常为 2 : 1。不完全佐剂中加卡介苗 （最
终浓度为2〜20mg/ml）或死的结核分枝杆菌，即为完全弗氏佐剂（ FCA ）。 一般首次注射时用 1 / 2体积F
CA 加上 1 ／2 体积的抗原进行乳化，第二次或第三次注射时用不完全佐剂或不用佐剂。如不加佐剂，则抗
原量增大 10-20 倍。
配制方法：按比例将羊毛脂与石蜡油置容器内，用超声波使之混匀，高压灭菌，置
4 C下保存备用。
在免疫动物前，先将弗氏佐剂与抗原按一定比例混合，佐剂和抗原体积比一般为
1： 1，制备成 "油包
水 "乳状液。因为含 SDS 很易促使其乳化成油包水抗原乳化复合物， 注射入动物体内时一定要保持乳化状态。
抗原用量视抗原分子量不同及免疫原性及免疫动物不同而有一定差异，
无统一标准和固定模式。 一般是每兔
约 2kg 重）或每羊（约 20kg 重）第 1 次注射抗原 1mg ，以后逐次增加抗原量，最多每次不超过 3mg 。
佐剂与抗原乳化可按如下方法进行：
弗氏佐剂是目前动物实验中最常用的佐剂， 分为不完全弗氏佐剂和完全弗氏佐剂。 不完全弗氏佐剂是液
弗氏佐剂是目前动物实验中最常用的佐剂， 分为不完全弗氏佐剂和完全弗氏佐剂。 不完全弗氏佐剂是液
弗氏佐剂是目前动物实验中最常用的佐剂， 分为不完全弗氏佐剂和完全弗氏佐剂。 不完全弗氏佐剂是液
弗氏佐剂是目前动物实验中最常用的佐剂， 分为不完全弗氏佐剂和完全弗氏佐剂。 不完全弗氏佐剂是液
1) 研磨法：先将佐剂加热并取适量放入无菌的玻璃研钵内，待冷却后再缓缓滴入等体积的抗原溶
液，边滴边按同一方向研磨，滴加抗原的速度要慢。待抗原全部加入后，继续研磨一段时间，使之成为乳白 色粘稠的油包水乳剂。本法适于制备大量的佐剂抗原，缺点是研钵壁上粘附大量乳剂，抗原损失较大。
注射器混合法：将等量的弗氏佐剂和抗原溶液分别吸入两个注射器内，两注射器之间以一细胶管 相连，注意排净空气，然后交替推动针管，直至形成粘稠的乳剂为止。本法优点是容易做到无菌操作，抗原 损失少，适用于制备少量的抗原乳剂。但同时难以乳化完全，个别抗原，用塑料注射器根本推不动，而用玻 璃注射器又有渗漏。 制备好的乳化剂经鉴定才能适用。 鉴定方法是将乳化剂滴入冷水中， 若保持完整不分散， 成滴状浮于水面，即乳化完全，为合格的油包水剂。
超声：实验室条件好点的，比如说有超声破碎仪的，一定要控制超声频率和时间，超声容易激
发一些自由基，对抗原有未知损害。乳化方法要根据抗原和需要而定。
2． 氢氧化铝佐剂
取 5% 硫酸铝溶液 250ml ，在强烈搅拌下加入 5% 氢氧化钠溶液 100ml ，用生理盐水离心洗涤沉淀 2 次， 再悬入生理盐水中使达 250ml 。免疫接种时，取适量氢氧化铝佐剂加等体积抗原即可免疫。
钾铝矶（硫酸铝钾）在一定pH条件下产生氢氧化铝胶体吸附抗原而产生佐剂效应。制备方法是用生理盐
水溶解蛋白质抗原，在搅拌下缓慢滴入一定量
4C保存备用。明矶佐剂一般
10%硫酸铝钾溶液，用 NaOH调pH到6. 5，此时溶液变成
乳状悬液，离心后去掉上清液，沉淀用生理盐水洗涤二次，加入硫柳汞防腐, 用于肌肉注射，皮下注射容易引起肉芽肿和脓肿。
脂质体包封抗原后，可使抗原延缓释放，并且脂质体颗粒有刺激机体免疫反应的作用。因此，用脂质体 包封的抗原免疫动物可提高免疫效果。
以抗原免疫动物获得抗血清是制备抗体的经典方法。为了提高免疫效果，在免