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KAPA文库定量试剂盒说明书
KAPA文库定量试剂盒说明书
1. 产品说明：
文库准确的定量对于二代测序的结果是特别重要的，过低估计文库的大小，导致clusters或多重模板太多，数据质量不释缓冲液〔10mM Tris-HCL，+%吐温20〕，稀释体系如下：
稀释缓冲液 DNA文库原液 总体积
1019μl 1μl 1010μl
确定双链DNA文库的质量和平均片段长度；
按1:1010稀释的DNA文库再进展2倍稀释，共稀释3个梯度，即：1:2000、1:4000、
1:8000。假如DNA文库浓度较高，须要稀释更多的梯度，但要在试剂盒标准品的稀释范围内。
其次步：试验设计：
试剂盒中包含6个DNA标准品，qPCR时每板都须要做。每个文库须要做12个反响，1:1010、1:2000、1:4000、1:8000共4个梯度，每个梯度做3个重复。 第三步：qPCR试剂打算：










确认全部试剂充分溶解并漩涡震荡混匀后待用：
将1ml Primer Premix与5ml的KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix〔2×〕充分混合； 6个10倍稀释的DNA标准品；
DNA文库稀释4个梯度，即：1:1010、1:2000、1:4000、1:8000。 第四步：qPCR
6个标准品和DNA文库定时时，须要做三个重复孔，建议体系为20μl：
试剂
引物与KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix的混合物 ddH2O
稀释的DNA文库及标准品〔1~6〕 总体积
参加量 12μl 4μl 4μl 20μl
*也适用于10μl体系，引物与KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix的混合物加6μl，模板加4μl。 第五步：qPCR程序：
程序 预变性 变性 退火/延长
第六步：分析：
标准品浓度见下表：
温度 95℃ 95℃ 60℃
时间 5min 30s 45s
35cycles
*每个标准品做三个重复孔，每20μl体系运用4μl的标准品；输入正确的标准品浓度；DNA标准品浓度是试剂盒中供应的，而不是在反响体系中的浓度。每个反响孔标准品和文库参加的体积是一样的，当计算文库浓度时，不须要考虑体积，也不须要模板在反响体系中的浓度。










确认标准品扩增效率在90~110%； ~110%；
注：建议将DNA文库进展2倍梯度稀释，有利于确认数据的精确性，且有利于解决出现的问题。