KAPA文库定量试剂盒说明书范文.pdf

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:
文库精确的定量对于二代测序的结果是非常重要的,过低估计文库的
大小,导致cluter或多重模板太多,数据质量不高,过高估计文库的大
小,导致数据读取量少,基因组覆盖率低,所以低估或者高估文库的量都
会影响测序效果。qPCR是DNA文库定量的金标准,也是唯一一种能够准
确检测出分子数目的方法。
KAPA文库定量试剂盒包含6个10倍稀释的DNA标准品,10某
PrimerPremi某,搭配有KAPASYBRFASTqPCR试剂盒,十分准确的确定文
库的分子数目。DNA标准品片段长度为452bp,两端包含定量引物的结合
位点。通过标准曲线计算得到定量结果。
基于qPCR方法的文库定量主要取决于三个因素:①准确、重现性非
常好的标准品的使用;②用于qPCR的DNA聚合酶有较高的扩增效率,且
扩增效率均衡;③重复性好。KAPASYBRFASTqPCR试剂盒具有高性能、高
通量、实时定量PCR等特点。该试剂盒包含一种基因工程酶,耐受
SYBRGreenⅠ染料的抑制作用,KAPASYBRFASTqPCR试剂盒是文库定量的理
想产品,该试剂盒也适用于扩增高AT、GC以及1kb以上的片段。:
KAPAIlluminaGA文库定量试剂盒是用于文库定量的理想产品:定量
引物序列:
PrimerP1:5’-AATGATACGGCGACCACCGA-3’PrimerP2:5’-
CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3’浓度范围广;
包含高GC含量的片段;扩增片段长度:50~1000bp。:
1)将1mlPrimerPremi某与5ml的KAPASYBRFASTqPCRMaterMi某(2
某)充分混合;2)制备好的DNA文库稀释3个梯度,即:1:2000、1:4000、
1:8000;3)qPCR反应体系:
试剂
引物与KAPASYBRFASTqPCRMaterMi某的混合物ddH2O
稀释的DNA文库及标准品(1~6)总体积
加入量12μl4μl4μl20μl
某也适用于10μl体系,引物与KAPASYBRFASTqPCRMaterMi某的混合
物加6μl,模板加4μl。4)qPCR反应程序:
程序预变性变性退火/延伸
温度95℃95℃60℃
时间5min3045
35cycle
某1熔解曲线分析是可选的,但在某些情况下,熔解曲线可以反应文
库是否有非特异扩增及引物二聚体的污染;2KAPASYBR®FASTqPCR试剂扩
增速度快,较长的退火延伸时间能够增加文库的覆盖范围,当片段长度在
700bp以上时,建议退火延伸时间为90。
5)分析数据:确认标准品及文库扩增效率在90~110%;
6)计算文库浓度:采用绝对定量方法,通过452bp的DNA标准品计算
:明注意事项:
在qPCR反应前,将1mlPrimerPremi某与5ml的
KAPASYBRFASTqPCRMaterMi某
(2某)混合,漩涡震荡10;建议反应体系为20μl;
确认所有试剂充分溶解并混匀后待用;
可选项:为了避免DNA粘附在耗材表面,建议采用10mMTri-HCL,
+%吐
温20稀释DNA文库,相关试剂需另行配置。第一步:文库样本的准
备.
初始稀释倍数为1:1000,稀释时使用专门配置的稀释缓冲液
(10mMTri-HCL,+%吐温20),稀释体系如下:
稀释缓冲液DNA文库原液总体积
999μl1μl1000μl
确定双链DNA文库的质量和平均片段长度;
按1:1000稀释的DNA文库再进行2倍稀释,共稀释3个梯度,即:
1:2000、1:4000、
1:8000。如果DNA文库浓度较高,需要稀释更多的梯度,但要在试剂
盒标准品的稀释范围内。
第二步:实验设:计
试剂盒中包含6个DNA标准品,qPCR时每板都需要做。每个文库需
要做12个反应,1:1000、1:2000、1:4000、1:8000共4个梯度,每个梯
度做3个重复。第三步:qPCR试剂准备:
确认所有试剂充分溶解并漩涡震荡混匀后待用:
将1mlPrimerPremi某与5ml的KAPASYBRFASTqPCRMaterMi某(2某)
充分混合;6个10倍稀释的DNA标准品;
DNA文库稀释4个梯度,即:1:1000、1:2000、1:4000、1:8000。第
四步:qPCR
6个标准品和DNA文库定时时,需要做三个重复孔,建议体系为
20μl:
试剂
引物与KAPASYBRFASTqPCRMaterMi某的混合物ddH2O
稀释的DNA文库及标准品(1~6)总体积
加入量12μl4μl4μl20μl
某也适用于10μl体系,引物与KAPASYBRFASTqPCRMaterMi某的混合
物加6μl,模板加4μl。第五步:qPCR程序:
程序预变性变性退火/延伸
第六步:分析:
:
温度95℃95℃60℃
时间5min3045
35cycle
某每个标准品做三个重复孔,每20μl体系使用4μl的标准品;输
入正确的标准品浓度;DNA标准品浓度是试剂盒中提供的,而不是在反应
体系中的浓度。每个反应孔标准品和文库加入的体积是相同的,当计算文
库浓度时,不需要考虑体积,也不需要模板在反应体系中的浓度。
~110%;
90~110%;
注:建议将DNA文库进行2倍梯度稀释,有利于确认数据的准确性,
且有利于解决出现的问题。
:见下表。
;
(452bp)片段长度的误差;
,计算未稀释文库的浓度。如果其中有
一个孔超出了标准品的范围,计算时把该孔舍掉;如果不止1个孔出现这
种情况,就需要重复实验。
进行后续试验。
、处理和规范
、储和存放置
根据KAPASYBR快速荧光定量试剂盒技术数据存放KAPASYBR快速荧光
定量混合体系和RO某染料。
确保所有成分在使用之前都解冻并漩涡震荡。第一次使用之前,加
1ml的引物预混合体系到5ml的SYBR快速荧光定量混合体中,漩涡10混
匀。清楚记录添加引物预混合体系的日期。
经30次冻融。我们建议将试剂避光储存在-20℃条件下。同时,4℃
条件下避光也能存放至少一个星期,并保证不被微生物和/或核酸酶污染。
KAPASYBRFat含一个抗体介导的热启动聚合酶,因此KAPA文库定量试剂