血清清蛋白的分离.doc

血清清蛋白的分离、纯化及鉴定
一、实验目的
1、掌握盐析法分离蛋白质的原理和基本方法
2、掌握凝胶层析法分离蛋白质的原理和基本方法
3、掌握离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法
4、掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法
5、了解柱层析技术
二、实验原理
(一)粗提(盐析法)
由于血清中各种蛋白质分子的颗粒大小和亲水程度不同,故盐析所需的盐浓度也不一样。
调节盐的浓度可使不同的蛋白质沉淀从而达到分离的目的
血清清蛋白
球蛋白
半饱和硫酸铵
清蛋白不沉淀,上清
球蛋白沉淀,蒸馏水溶解
(二)脱盐(凝胶层析)
盐析分离的蛋白质溶液中含有大量无机盐,必须先脱盐后才能进一步纯化
脱盐有多种方法,本实验采用凝胶层析法
凝胶层析法主要是根据混合物中各种物质分子大小的不同而将其分离的技术
(三)纯化(离子交换层析)
离子交换层析是指流动相中的离子和固定相上的离子进行可逆的交换,利用化合物的电荷性质及电荷量不同进行分离

DEAE带正电荷
清蛋白及a、b球蛋白的pI< ,带负电荷
g–球蛋白pI >,
带正电荷
清蛋白及a、b球蛋白被层析柱吸附,
g-球蛋白被洗脱

DEAE带正电荷
清蛋白pI ,带负电荷多
a、b球蛋白pI ~,
带负电荷少
a、b球蛋白被洗脱,清蛋白仍被吸附

DEAE带正电荷
缓冲液离子强度增加
清蛋白被洗脱
(四)纯度测定(醋酸纤维素薄膜电泳)
五、注意事项
1、所用血清应新鲜,无沉淀物及细菌滋生。
2、使用时勿将各时段所应用的溶液浓度弄错。
3、上样时,滴管应沿柱上端内壁加入样品,动作应轻、慢,勿将柱床冲起。流洗平衡时亦应如此。
4、洗脱时应注意及时收集样品,切勿使蛋白质峰溶液流失,并注意层析柱不要流干,进入空气。
5、切勿将检测蛋白质的磺基水杨酸与检查SO42-的BaCl2混淆,因二者与相应物质生成的沉淀均为白色。
6、葡聚糖凝胶价钱昂贵,要回收再生,避免损耗,严禁倒掉