SOD 测定方法.doc

SOD_测定方法SOD_测定方法
SOD
氮蓝四唑(NBT)法测定超氧物歧化酶(SOD)活力
一、原理
超氧物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)普遍存在于动、植物体内,是一种清除超氧阴离子自由基(O2-)的酶。实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑(NBT)在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有氧化物质存在下,核黄素可被光还原,被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O2,可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙,后者在560nm处有最大吸收。而SOD可清除O2,从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后,反应液蓝色愈深,说明酶活性愈低,反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。
二、材料、仪器设备及试剂
(一)材料;水稻或小麦叶片
(二)仪器设备:;;;(反应试管处照度为4000Lx);。
(三)试剂 1. 磷酸缓冲液();2. 130mmol/L 甲硫氨酸(Met)溶液:称
; 氮蓝四唑溶液:,避光保存;4. 100μmol/L EDTA-Na2溶液:-Na2用磷酸缓冲液定容至
1000ml;5. 20μmol/L 核黄素溶液:。
三、实验步骤
1. 酶液提取
取一定部位的植物叶片(视需要定,去叶脉),1ml预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆,加缓冲液使终体积为5ml。~2ml于1000rpm下离心20min,上清液即为SOD粗提液。
2. 显色反应
取5ml指形管(要求透明度好)4支,2支为测定管,另2支为对照管,按下列加入各溶液:试剂(酶)用量(ml)终浓度(比色时) 750μmol/L 100μmol/L EDTA- 20μmol/L ,其它各管于4000Lx日光下反应20min(要求各管受光情况一致,温度高时间缩短,低时延长)。
3. SOD活性测定与计算
至反应结束后,以不照光的对照管做空白,分别测定其它各管的吸光度。
四、结果计算
已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位表示,按下式计算SOD活性。SOD总活性=(Ack-AE)×V/(Ack××W×Vt)
上式中,SOD比活力=SOD总活性蛋白质含量式中SOD总活性以每克鲜重酶单位表示;比活力单位以酶单位/mg蛋白表示Ack照光对照管的吸光度AE样品管的吸光度V样品液总体积(ml)Vt测定时样品用量(ml)W样鲜重(g)蛋白质含量单位为:mg蛋白/g鲜重。
超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定
【实验原理】
SOD是含金属辅基的酶,它催化以下反应:
02-+02-+ 2H+ H