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从动物胰脏中提取糜蛋白酶的方法
本发明公开了一种从动物胰脏中提取糜蛋白酶的方法。本发明的技术方案是利用硫酸溶液将胰腺细胞中含有的酶原提取出来,然后根据等电点沉淀的原理,调节pH,硫酸铵分级盐溶、盐析将糜蛋白酶原等沉淀析出。本法每千克胰脏可得5g糜蛋白酶。
【专利说明】从动物胰脏中提取糜蛋白酶的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】,具体地说涉及从动物胰脏中分离糜蛋白酶的方法。
【背景技术】
[0002]糜蛋白酶是从牛胰腺或猪胰腺中分离纯化得到的一种蛋白水解酶,能迅速分解变性蛋白质,作用、用途与胰蛋白酶相似,比胰蛋白酶分解能力强、毒性低、不良反应小。可使粘稠的痰液稀化,便于咳出,对脓性和非脓性痰液均有效。也用于创伤或手术后伤口愈合。可用于白内障摘除。
[0003]糜蛋白酶在药理和临床上的功用主要有两方面:一、消炎:对各种炎症、炎性水肿、血肿、溃疡及血栓等有较好疗效。二、抗癌:能促进抗癌药物向病灶渗透,促使化疗药物发挥作用,局部大剂量使用时作用更强。大剂量使用可治疗多种肿瘤,如乳腺癌、宫颈癌、胃癌等,并且无任何毒副作用或不良反应。
[0004]随着糜蛋白酶的应用广泛,使得国际市场对本产品的需求不断扩大,质量要求上也更加严格,要求产品有更高的质量:《中国药典》(2010版)规定,糜蛋白酶的效价不得少于1000单位/毫克。针对效价提高的要求,本发明对传统工艺进行了改进和创新。
【发明内容】
[0005]本发明的目的提供了一种分离提取糜蛋白酶方法。采用以下工艺方案予以实现上述目的:
[0006]本发明的技术方案是:利用硫酸溶液将胰腺细胞中含有的酶原提取出来,然后根据等电点沉淀的原理,调节PH,硫酸铵分级盐溶、盐析将糜蛋白酶原等沉淀析出,包括如下步骤:`[0007](I)提取工序:将新鲜的胰脏绞碎成胰浆,称重。按每千克胰浆加入2~3L的
~,浸溃20~28小时,将浸溃物置滤袋过滤,滤干后弃去滤渣,留取滤液;
[0008](2)盐溶工序:浸溃液中加入硫酸铵,达到30~50%饱和度,静置10~16小时,过滤,留取滤液;
[0009](3)盐析工序:滤液中加入硫酸铵,达到50~80%饱和度,静置10~16小时,过滤,留取滤饼;
[0010](4)每克滤饼加入2~5ml的水溶解,重复上述⑵、(3)操作;
[0011](5)每克滤饼用I~3ml的水溶解,~Iml的饱和硫酸铵溶液,~;
[0012](6)结晶工序:溶液在20~30°C温度中静置24~72小时,有针状糜蛋白酶结晶析出;
[0013](7)干燥工序:取沉淀物,干燥,即得糜蛋白酶粗品。
[0014]与现有技术相比,本发明的优点和积极效果:[0015]与传统生产技术相比,采用本发明技术生产糜蛋白酶不仅效价高,能够达到1200iu/mg,关键是生产成本低,生产工艺温和,容易控制,非常适用于现代工业化大生产。
【具体实施方式】
[0016]下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
[0017]实施例1
[0018]所述的利用稀酸溶液将胰腺细胞中含有的酶原提取出来,然后根据等电点沉淀的原理,调节pH以沉淀除去大量的酸性杂蛋白以及非蛋白杂质,再以硫酸铵分级盐析将糜蛋白酶原等沉淀析出,包括如下步骤:
[0019]:
[0020],用镊子和剪刀将脂肪结缔组织等除去,置绞碎机中绞碎,称重15Kg;
[0021],,在浸溃期中每小时搅拌I次;
[0022],
15L浸溃I小时,滤干后弃去滤洛;
[0023]、盐析工序:
[0024],体积为`,置塑料桶中,每1000ml溶液中加入固体硫酸铵242g,达到40%饱和度,共加10.`866Kg固体硫酸铵,静置12小时;
[0025],留取过滤液,滤液体积为44L,固体弃去;
[0026],达到70%饱和度,,静置12小时;
[0027],留取滤饼,,弃滤液;
[0028],,,,%和70%饱和度沉淀;
[0029]%饱和度沉淀物,,,,并用5mol/;
[0030]°C恒温箱中48小时,有针状的糜蛋白酶粗品结晶析出;
[0031]:
[0032]取沉淀物,置真空干燥箱内干燥,即得糜蛋白酶粗品,,。
[0033]实施例2
[0034]:
[0035],用镊子和剪刀将脂肪结缔组织等除去,置绞碎机中绞碎,称重
IOKg;
[0036],,在浸溃期中每小时搅拌I次;
[0037],,滤干后弃去滤渣;
[0038]、盐析工序:
[0039],,置塑料桶中,每1000ml溶液中加入固体硫酸铵225g,达到35%饱和度,共加8.`415Kg固体硫酸铵,静置12小时。
【权利要求】
,其特征在于,该方法包括如下步骤:(1)提取工序:将动物的胰脏绞碎成胰浆,用硫酸溶液浸溃,过滤,留取滤液;(2)盐溶工序:滤液中加入硫酸铵,使硫酸铵的饱和度达到30~50%,静置,过滤,留取滤液;(3)盐析工序:滤液中加入硫酸铵,使硫酸铵的饱和度达到50~80%,静置,过滤,留取滤饼;(4)所得滤饼加水溶解,加入饱和硫酸铵溶液,~;(5)结晶工序:溶液静置至有针状糜蛋白酶结晶析出;(6)干燥工序:取沉淀物,干燥,即得糜蛋白酶。
,其特征在于:步骤(1)中,~;胰浆与硫酸溶液的重量比为1:2~1:3;浸溃时间是20~28小时。
,其特征在于:步骤(4)中,水与滤饼的重量比为I:I~3:I;~;加入的饱和硫酸铵溶液与滤饼的重量比为1:10~I:10
,其特征在于:步骤(4)中,水与滤饼的重量比为1:1~2:1;~;加入的饱和硫酸铵溶液与滤饼的重量比为1:6~I:
,其特征在于:步骤(5)中,溶解静置环境温度为20~300C;~;每1000ml溶液中加入固体硫酸铵的重量为300~400g。
,其特征在于:步骤(5)中,~;每1000ml溶液中加入固体硫酸铵的重量为340~370g。
,其特征在于:所述动物胰脏为新鲜的牛胰脏、新鲜的猪胰脏。
,其特征在于:在步骤(4)之前,还包括将所得滤饼用水溶解,重复步骤(2)和步骤(3)的操作步骤,水与滤饼的重量比为2:1~5:1。
-8任意之一所述的制备方法制备得到的糜蛋白酶。