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试验一：从毛霉中提取蛋白酶及分离方案
组员：周云线 周丽玲 陆江妙
1 试验原理
毛霉又叫黑霉、长毛霉接合菌亚门接合菌纲毛霉目毛霉科真菌中一个大属。以孢囊孢子和接合孢子繁殖菌丝无隔、多核、分枝状，在基物内外能广泛蔓延，无假根或匍匐菌丝，在高温、高湿度和通风不良条件下生长良好。毛霉常出现在酒药中，能糖化淀粉并能生成少许乙醇，产生蛋白酶，有分解大豆蛋白能力，中国多用来做豆腐乳、豆豉。很多毛霉能产生草酸、乳酸、琥珀酸及甘油等，有毛霉能产生脂肪酶、果胶酶、凝乳酶等。工业中利用其蛋白酶以酿制腐乳、豆豉等。皮革工业脱毛和软化已大量利用蛋白酶，既节省时间，又改善劳动卫生条件。蛋白酶还可用于蚕丝脱胶、肉类嫩化、酒类澄清等。
酶活定义： 在4 0℃， p ， 1分钟内水解酪蛋白产生 l微克酪氨酸所需酶量为1个蛋白酶活力单位。蛋白酶水解络蛋白，其产物络氨酸能在碱性条件下使福林-酚试剂还原，生产钼蓝和钨蓝，在680nm下测定其吸光度，可求得蛋白酶活力。考马斯亮蓝是一个染料，在游离状态下呈红色，当它和蛋白质结合后变为青色。蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收，其光吸收值和蛋白质含量成正比，所以可用于蛋白质定量测定。测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg／mL，是一个常见微量蛋白质快速测定方法。
蛋白质在水中溶解度受到溶液中盐浓度影响。通常在低盐浓度情况下，蛋白质溶解度随盐浓度升高而增加，这种现象称为盐溶。而在盐浓度升高到一定浓度后，蛋白质溶解度又随盐浓度升高而降低，这种现象称为盐析。在蛋白质盐析中，硫酸铵最为常见，这是因为硫酸铵在水中溶解度最低而且温度系数小不影响酶活性，分离效果好。
2 仪器
恒温培养箱、振荡摇床、恒温振荡器、离心机、722分光光度计、pH计、恒温水浴锅
培养基
斜面培养基PDA培养基： 称取200g马铃薯，洗净去皮切成小块，加水1000mL煮沸半个小时或高压蒸煮20分钟，纱布过滤，再加10-20g葡萄糖和17-20g琼脂，充足溶解后趁热纱布过滤，分装试管，每试管约5-10mL（视试管大小而定），121℃）灭菌20分钟左右后取出试管摆斜面，冷却后贮存备用。
固体培养基：麸皮10g，水12mL，自然 pH值，适量装入 250mL三角瓶中，l2l℃灭菌30min后趁热立即摇散，备用。
液体培养基：蛋白胨20g、葡萄糖10g、氯化镁2g、磷酸二氢钾2g，250mL锥形瓶装样量50mL，l2l℃灭菌30min，培养72h。
4 相关溶液
福林-酚试剂、标准酪氨酸溶液（1000mL）、（1000ml）、2%酪蛋白溶液（500mL）、（1000mL）、（1000mL），（1000mL）、1mg/mL牛血清蛋白标准溶液
考马斯亮蓝染色液：称100mg考马斯亮兰G—250，溶于50ml 95%乙醇后，再加入120ml 85%磷酸，用水稀释至1升。
5 方法
（1） 孢子菌悬液（血球计数板计数，106个/mL），斜面培养基培养48h后，用5mL生理盐水洗脱下孢子，将孢子菌悬液吸至无菌试管（无菌棉花或纱布过滤），梯度稀释法稀释至106个/mL。
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