从毛霉中提取蛋白酶【DOC精选】.doc

实验一:从毛霉中提取蛋白酶及分离方案组员:周云线周丽玲陆江妙 1 实验原理毛霉又叫黑霉、长毛霉接合菌亚门接合菌纲毛霉目毛霉科真菌中的一个大属。以孢囊孢子和接合孢子繁殖菌丝无隔、多核、分枝状,在基物内外能广泛蔓延,无假根或匍匐菌丝,在高温、高湿度以及通风不良的条件下生长良好。毛霉常出现在酒药中,能糖化淀粉并能生成少量乙醇,产生蛋白酶,有分解大豆蛋白的能力,我国多用来做豆腐乳、豆豉。许多毛霉能产生草酸、乳酸、琥珀酸及甘油等,有的毛霉能产生脂肪酶、果胶酶、凝乳酶等。工业中利用其蛋白酶以酿制腐乳、豆豉等。皮革工业的脱毛和软化已大量利用蛋白酶,既节省时间,又改善劳动卫生条件。蛋白酶还可用于蚕丝脱胶、肉类嫩化、酒类澄清等。酶活定义: 在40℃, 条件下, 1分钟内水解酪蛋白产生 l微克酪氨酸所需的酶量为 1个蛋白酶活力单位。蛋白酶水解络蛋白,其产物络氨酸能在碱性条件下使福林-酚试剂还原,生产钼蓝与钨蓝,在680nm 下测定其吸光度, 可求得蛋白酶活力。考马斯亮蓝是一种染料,在游离状态下呈红色,当它与蛋白质结合后变为青色。蛋白质-色素结合物在 595nm 波长下有最大光吸收,其光吸收值与蛋白质含量成正比,因此可用于蛋白质的定量测定。测定蛋白质浓度范围为0~1000 μg/ mL ,是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。蛋白质在水中的溶解度受到溶液中盐浓度的影响。一般在低盐浓度的情况下,蛋白质的溶解度随盐浓度的升高而增加,这种现象称为盐溶。而在盐浓度升高到一定浓度后,蛋白质的溶解度又随盐浓度的升高而降低,这种现象称为盐析。在蛋白质的盐析中,硫酸铵最为常用,这是由于硫酸铵在水中的溶解度最低而且温度系数小不影响酶活性,分离效果好。 2仪器恒温培养箱、振荡摇床、恒温振荡器、离心机、 722 分光光度计、 pH 计、恒温水浴锅 3 培养基斜面培养基 PDA 培养基:称取 200g 马铃薯, 洗净去皮切成小块,加水 1000m L 煮沸半个小时或高压蒸煮 20 分钟,纱布过滤,再加 10-20g 葡萄糖和 17-20g 琼脂,充分溶解后趁热纱布过滤,分装试管,每试管约 5-10m L(视试管大小而定), 121 ℃)灭菌 20分钟左右后取出试管摆斜面,冷却后贮存备用。固体培养基:麸皮 10g ,水 12mL ,自然 pH 值,适量装入 250mL 三角瓶中, l2l ℃灭菌 30min 后趁热及时摇散,备用。液体培养基: 蛋白胨 20g 、葡萄糖 10g 、氯化镁 2g 、磷酸二氢钾 2g, 250mL 锥形瓶装样量 50mL , l2l ℃灭菌 30min ,培养 72h 。 4 相关溶液福林-酚试剂、标准酪氨酸溶液( 1000mL )、 磷酸缓冲液( 1000ml )、2% 酪蛋白溶液( 500mL )、 三氯乙酸溶液( 1000mL )、 碳酸钠溶液( 1000mL ), ( 1000mL )、 1mg/mL 牛血清蛋白标准溶液考马斯亮蓝染色液:称 100mg 考马斯亮兰 G—250 ,溶于 50ml 95% 的乙醇后, 再加入 120ml 85% 的磷酸,用水稀释至 1升。 5方法( 1) 孢子菌悬液(血球计数板计数, 10 6个/mL ) ,斜面培养基培养 48h 后,用 5mL 生理盐