16S rDNA鉴定细菌的方法.doc

16S_rDNA鉴定细菌的方法16S rDNA鉴定细菌的方法
细菌16S rDNA鉴定主要分为7个部分:
,
,电泳检测纯度与大小。


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试剂:
培养基:通常选择组分简单且细菌生长良好的培养基(培养基组分过于复杂会影响DNA的提取效果,也可以在裂解细菌前用TE缓冲液对菌体进行洗涤。)。
1M Tris-HCl (, , )(1L): Tris,加浓盐酸约(70ml, 60ml, 42ml),高温高盐灭菌后,室温保存。冷却到室温后调pH,每升高1℃,。(Tris-HCl缓冲液(,25℃) 50ml (Tris)溶液与x ml 盐酸混匀后,加水稀释至100ml 。Tris缓冲液不仅被广泛用作核酸和蛋白质的溶剂,Tris也是蛋白质电泳缓冲液的主要成分之一)
EDTA()(1L): Na2EDTA•2H2O,(约20g),高温高压灭菌,室温保存。(配置方法 1. Na2EDTA•2H2O,置于1L烧杯中。 2. 加入约800mL的去离子水,充分搅拌。 3. (约20g NaOH)。注意:,EDTA才能溶解。 4. 加去离子水将溶液定容至1L。 5. 适量分成小份后,高温高压灭菌。6. 室温保存。)
10×TE Buffer(缓冲液)(,,)(1L):组分:100 mM Tris-HCl,10 mM EDTA。1M Tris-HCl(,,)取100ml, EDTA()取20ml。高温高压灭菌,室温保存。
1×TE Buffer用10×TE Buffer稀释10倍即可。
10%SDS(W/V):称10gSDS,68℃加热溶解,。室温保存。用之前在65℃溶解。配置时要戴口罩。
6、5M NaCl:,高温高压灭菌,4℃保存。
7、CTAB/NaCl(10%CTAB, NaCl): NaCl,加10g CTAB(十六烷基三甲基溴化铵),加热搅拌。用之前在65℃溶解。
8、氯仿/异戊醇:按氯仿:异戊醇=24:1(V/V)的比例加入异戊醇。
9、酚/氯仿/异戊醇(25:24:1):按苯酚与氯仿/异戊醇=1:1的比例混合Tris-HCl平衡苯酚与氯仿/异戊醇。
10、TAE缓冲液:使用液1×: mol/L Tris-乙酸, mol/L EDTA。浓储存液50×:242g Tris, ml 冰醋酸,100 ml mol/L EDTA ()。
11、6×上样缓冲液(100 ml):%溴酚蓝(BPB),40%蔗糖,10 mmol/L EDTA ()( ml),4℃保存。
12、%琼脂糖凝胶: