引物设计.ppt

引物设计
引物
引物的重要性
引物设计的原则
引物与PCR
引物设计软件
如何使用Primer Premier
引物同源性分析
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引物(primers)
引物是人工合成的两段寡核苷酸序列,一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补,另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。
→
←
3’
3’
5’
5’
Sense primer
Antisense primer
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引物的重要性
在整个PCR体系中, 引物占有十分重要的地位。PCR的特异性要求引物与靶DNA特异结合,不与其他非目的DNA结合,PCR的灵敏性要求DNA聚合酶能对引物进行有效的延伸,可见引物设计好坏与PCR结果密切相关。
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引物设计原则
引物长度
碱基分布的均衡性
Tm值
引物二级结构
引物3’端
引物5’端
引物的内部稳定性
引物的保守性与特异性
扩增区域的二级结构
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引物长度
一般为15-30个核苷酸,在做长片段PCR或做某些特殊的PCR时应使用较长的引物,但最多不超过50个核苷酸。
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碱基分布的均衡性
同一碱基连续出现不应超过5个
GC含量一般40-60%
GC含量太低导致引物Tm值较低,使用较低的退火温度不利于提高PCR的特异性
GC含量太高也易于引发非特异扩增。
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引物Tm值
一般要求:55℃-65℃。
计算:
对于低于20个碱基的引物,Tm值可根据Tm=4(G+C)+2(A+T)来粗略估算
对于较长引物,Tm值则需要考虑热动力学参数,从“最近邻位”的计算方式得到,这也是现有的引物设计软件最常用的计算方式。
Tm = △H/(△ S + R * ln (C/4)) + log ([K+]/(1 + [K+])) -
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引物二级结构
引物二聚体
尽可能避免两个引物分子之间3’端有有较多碱基互补
发夹结构
尤其是要避免引物3’端形成发夹结构,否则将严重影响DNA聚合酶的延伸。
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引物3’端
引物的延伸从3’端开始,因此3’端的几个碱基与模板DNA均需严格配对,不能进行任何修饰,否则不能进行有效的延伸,甚至导致PCR扩增完全失败。考虑到密码子的简并性,引物3’端最后一个碱基最好不与密码子第三个碱基配对。
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引物5’端
引物5’端可以有与模板DNA不配对碱基,在5’端引入一段非模板依赖性序列。
5’端加上限制性核酸内切酶位点序列(酶切位点5’端加上适当数量的保护碱基)。
5’端的某一位点修改某个碱基,人为地在产物中引入该位点的点突变以作研究。
5’端标记放射性元素或非放射性物质(如生物素、地高辛等)。
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