引物设计.ppt

Primer 、评估的软件,其主要界面分为序列编辑窗口(ank),引物设计窗口(Primer Design),酶切分析窗口(Restriction Sites)和纹基分析窗口(Motif),这里我们主要介绍其引物设计功能。
打开程序首先进入的是序列编辑参看
这是根据模板序列寻找引物的界面,在该界面中可以设定所要搜索的引物的类型,包括PCR引物,测序引物和杂交探针以及引物所在的链;另外也能设定搜索引物的范围,以及最终PCR产物的长度和引物的长度等。
Automatic Search 自动搜索
在结果窗口中给出了程序给该对引物的打分(rating)和上下游引物的起始位置和长度以及产物的长度。通过直接点击各对引物在相应引物搜寻界面中相应的显示引物的各种信息。包括其各种参数和各种可能存在的不利结构。
PRIMER PREMIER能即时分析引物二级结构。在左下的两排按钮可以显示发现了何种二级结构,也显示二级结构的自由能数值G 单位kcal/mol。
Edit Primer 引物编辑窗口可以用来设计用于定点突变的引物或分析一条已有引物序列。可以使用CTRL-X CTRL-C和CTRL-V快捷键来实施剪切拷贝和粘贴删除当前引物序列,并从剪贴板上粘贴是分析一条已有引物的好方法。进行粘贴时Paste 粘贴窗口会激活,用以将引物序列转化为反向互补或反向互补形式,也可以手工键入引物序列。一旦引物被编辑发点击Analyze 按钮即可分析编辑后的引物。
引物长度
,等于或少于15碱基的短引物有时用于简单的基因作图或特殊的文库构建library protocol ,28到35碱基的长引物对于从一系列高度相关的分子中扩增序列和特殊样本的克隆能起到重要作用。长PCR引物能给扩增带来更好的特异性,长引物也允许通过降低退火温度来能提高反应的灵敏度,不过长引物通常更易于形成包括发卡结构二聚体自身互补等二级结构。
理论上在合适的融链温度范围内最短的引物能在特异性和高效性间获得较好的平衡。
为设计一条高效引物有几个参数必须考虑PRIMER PREMIER搜索所考虑的参数依次如下
Tm 融链温度:PRIMER PREMIER根据相邻二碱基对作用理论nearest neighbor theory 来计算融链温度。PCR反应的合适Tm范围为56到63°C。
GC% GC含量:对于PCR反应来说GC含量在50%左右比较合适而对于测序引物和杂交探针来说GC含量至少应为50%。
Degeneracy 多义性:当设计多义引物时应尽量减少引物多义性这样会带来更好的特异性应尽量避免3末端的多义性因为这里即使一个碱基的错配都能阻止引物延伸。
3’ End Stability 3 末端稳定性:引物稳定性影响它的错配效率。一条理想的引物应该有一个稳定性较强的5 末端和相对稳定性较弱的3 末端,如果引物3 稳定性强有可能在即使5 末端不配对的情况下造成错配形成非特异性扩secondary bands。而3 末端稳定性低的引物较好的原因是在引物发生错配时由于3 末端不太稳定引物结合不稳定而难以延伸。
GC Clamp GC钳:引物与目的位点的有效结合需要有稳定的5 末端,这一段有较强稳定性的5 末端称为GC钳。它保证引物与模板的稳定结合。