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PCR 引物设计
PCR primer express
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聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)体外核酸扩增技术
能在一个试管内将所要研究微量的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断。
PCR使人们能通过试管内的数小时的反应将特定的DNA片段扩增数百万倍。该技术已成为分子生物学研究的重要技术体系，其建立极大地推动了生命科学的研究进展。在DNA重组与表达、基因结构分析与功能检测具有重要的应用价值。
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PCR技术的创建
Kary B. Mullis（穆利斯（美））
Khorana(1971)等提出在体外经DNA变性,与适当引物杂交,再用DNA聚合酶延伸,扩增DNA的设想。
1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现。
1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术。
1989年美国《Science》杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。
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1. PCR的基本原理
PCR的原理是根据待测DNA片段两端的核苷酸序列，设计并人工合成两个分别与DNA片段两端互补的寡聚核苷酸引物，在有过量的引物、过量的底物（4种dNTP）、DNA聚合酶以及模板的反应体系中，经过高温变性、低温退火和适温延伸三个阶段的循环周期，对DNA分子进行扩增。
由于新合成的DNA双链能够作为下一循环的模板，所以模板DNA以几何级扩增。一般经过30-35次扩增循环，可使目的基因DNA片段放大数百万倍。
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2. PCR体系的主要成分
①模板DNA（靶基因）
②特异引物
③底物dNTP
④耐热性DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）
⑤Mg2+缓冲液
1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA聚合酶。此酶具有以下特点：①耐高温，在70℃下反应2h后其残留活性大于原来的90%，在93℃下反应2h后其残留活性是原来的60%，在95℃下反应2h后其残留活性是原来的40%。②在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度()。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。
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（1）模板
单、双链DNA均可。
不能混有蛋白酶，特别是染色体中的组蛋白、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。
一般100ng DNA模板/100L。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。
（2）引物浓度
- mol/L
浓度过高易导致模板与引物错配,反应非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。
（3）Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)
- U/50 l
酶量过高可引起反应非特异性扩增;酶量过少则合成产物量减少。
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（4）dNTP浓度
取决于扩增片段的长度
四种dNTP浓度应相等，如果有一种浓度不同于其他几种，就会引起错配。
浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量
dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。
（5） Mg2+浓度
Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。
-。
Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高反应特异性降低，出现非特异扩增。Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。
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three steps:
Denaturation (变性):
将反应体系加热至90-97℃，使模板DNA完全变性成为单链，同时引物自身以及引物之间存在的局部双链也得以消除。
Annealing (退火):
当温度突然降低至45-65℃,引物与其互补的单链DNA模板在局部形成杂交链。
Extension (延伸):
将温度升高至70-74℃下，在Taq DNA 聚合酶和四种脱氧核糖核苷三磷酸底物及Mg2+存在的条件下引物沿着模板DNA延伸。
利用PCR仪来控制温度
3. How PCR works
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聚合酶链式反应
1. Denaturation
2. Annealing
3. Extension
以上三个步骤构成一个循环，新合成的DNA分子继续作为下一轮合成的模板，经多次循环（25～30）次即可达到扩增DNA片段的目的。
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5
Primer 1
5
Primer 2
Cy