引物设计.ppt

聚合酶链式反应(PCR)及引物设计
刘彩云
2011年7月22日

Content
聚合酶链式反应（PCR） 的技术原理及实验操作
PCR引物设计软件的使用（ Primer Prem：
10 ～ 50 mM Tris- Cl () 维持 Taq 酶作用环境 25 ～ 50 mM KCl 促进引物退火
100μg / ml 牛血清白蛋白 (BSA) 对酶有一定的保护性 ～ mM MgCl2 Taq 酶具有 Mg2+依赖性
2. dNTPs :
dATP、 dGTP 、dCTP、dTTP——底物
～ μM
PCR的成分和作用

3. 引物 (Primer-P)：
预扩增核酸片段两端的已知序列，决定特异性。
～ 1 μM
4. 模板DNA (Template):
最低102 ～ 105 DNA片段，实际用量远远
超过此量，用量需在实验中摸索。1 ～ 5 μl
PCR的成分和作用

5. Taq DNA 聚合酶
耐高热
～ 5 U / 100 μl
1U / 25 ～ 50μl
6. 水：
去离子水，补足整个反应体积。
PCR的成分和作用

实验原理
PCR技术原理
引物设计的原则
PCR的成分和作用
PCR反应体系
PCR反应条件优化
PCR的应用

常用30μl
各种成分的实际用量应根据实验者选用的该成分的终浓度及所拥有的储备液浓度进行核算。
PCR反应体系

操作： 5份标本 总体积 30μl ×6 = 180μl
1. 取一 ml Ep 管，加入下列试剂：
10×buffer： 3μl ×6 = 18μl
dNTPs: ×6 =
引物P1： ×6 =
引物P2： ×6 =
Taq 酶 (5U/μl)： × 6 =
水： × 6 =
共174μl，先用移液器 / 指弹混匀，后用离心机瞬时
混匀（管壁上液体沉至管底）。
PCR反应体系
冰上操作！

2. 另取 5 PCR管，分别加入上述液体29μl。
3. 分别取标本模板各1μl，加入上述5支PCR 管中，混匀，离心机瞬时离心，备用。
4. 反应条件：PCR扩增仪
PCR反应体系
94℃5 ′
94℃ 30″
60℃ 30″
72℃ 1′
30个循环
72 ℃ 5′

实验原理
PCR技术原理
引物设计的原则
PCR的成分和作用
PCR反应体系
PCR反应条件优化
PCR的应用

⑴ 变性温度和时间：
保证模板DNA解链完全是保证整个PCR扩增成功的关键。
加热90～95℃，30 ～ 60 s，再复杂的DNA分子也可变性为单链。根据模板DNA复杂程度，可以调整变性温度和时间。一般情况下选择94 ℃ 30 ″，可使各种复杂的DNA分子完全变性。
PCR反应条件优化

⑵ 退火温度和时间：
PCR扩增特异性取决于复性过程中引物与模板
的结合。
退火温度的选择，可根据引物的长度和G+C含量确定，一般位于40 ～ 60℃，30 ～ 60 s。
退火温度越高，产物特异性越高。退火温度越低，产物特异性越低。
设置退火温度梯度，摸索最佳退火温度！
PCR反应条件优化