crispr cas9基因敲除载体构建试剂盒说明书v1.1.pdf

CRISPR Cas9基因敲除试剂盒 产品说明书    本说明书适用于以下产品:  货号货号CRISPR/Cas9试剂盒 CR0001 CRISPR/Cas9Nick试剂盒 CR0002 pCas9/gRNA1载体 CR1001 pCas9/gRNA3载体 CR1004 pTYNE验证载体 CR1011            北京英茂盛业生物科技有限公司       北京市昌平区沙河镇青年创业大厦B‐916       Tel:010‐62495135       Emai:order@       Web site:书 产品内容 Cas9基因敲除试剂盒 货号CR0001 内容 包装 pCas9/gRNA1 载体 3ug in TE Buffer pTYNE验证载体 3ug in TE Buffer pCas9‐P阳性对照载体 3ug in TE Buffer pCas9‐N阴性对照载体 3ug in TE Buffer Cas9Nicknase基因敲除试剂盒 货号CR0002 内容 包装 pCas9/gRNA3载体 3ug in TE Buffer pTYNE验证载体 3ug in TE Buffer pCas9‐Pf阳性对照载体 3ug in TE Buffer pCas9‐Pr阳性对照载体 3ug in TE Buffer pCas9/gRNA1 载体 货号CR1001 内容 包装 pCas9/gRNA1 载体 3ug in TE Buffer pCas9/gRNA3 载体 货号CR1004 内容 包装 pCas9/gRNA3 载体 3ug in TE Buffer pTYNE验证载体 货号CR1011 内容 包装 pTYNE验证载体 3ug in TE Buffer  保存条件: ‐20℃冻存     所需其他材料 ¾EcoRV 限制性内切酶。T4 DNA ligase。 ¾dH5a、Top10或其他常用感受态细胞。 ¾细胞培养基及其他细胞培养相关试剂。 ¾HEK293T细胞或293V细胞(货号C1201)。 ¾转染试剂(Polyfect‐V货号P2010‐1)。   1 北京英茂盛业生物科技有限公司 : 010‐62495135 Email: order@产品说明书 CRISPRCas9基因敲除原理CRISPR (clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats)是一种来自细菌降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫机制。在该机制中,Cas蛋白(CRISP‐associated protein)含有两个核酸酶结构域,可以分别切割两条DNA链。一旦与crRNA(CRISPR RNA)和tracrRNA结合形成复合物,Cas蛋白中的核酸酶即可对与复合物结合的DNA进行切割。切割后DNA双链断裂从而使入侵的外源DNA降解。 1、Cas9蛋白 us pyogenes 的Cas9由于PAM识别序列仅为2个碱基(GG),几乎可以在所有的基因中找到大量靶点,因此得到广泛的应用。Cas9蛋白在目前测试过的几乎所有生物和细胞中均有活性,包括细菌、酵母、植物、鱼、以及哺乳动物细胞。识别RNA(gRNA)可以通过载体表达或者化学合成后与Cas9蛋白共同进入细胞,对特异DNA序列剪切,从而促使DNA发生NHEJ ( nonhomologous end‐joining)导致的基因缺失或同源重组,实现基因敲除。 Cas9对DNA切割示意图:  2、Cas9Nicknase蛋白 Cas9Nicknase是Cas9蛋白的D10A突变体,切割DNA单链。由于DNA上的Nick缺口会很快被细胞修复,一般不会造成基因突变。Cas9Nicknase需要成对的gRNA辅助才能实现DNA双链断裂。 采用Nicknase蛋白可以提高基因敲除的特异性,但是对gRNA的设计要求较高。敲除效率也比Cas9蛋白低一些。 简单地说,Cas9基因敲除效率更高,操作更容易;Cas9Nicknase特异性更高。您可以根据实验设计需要进行选择。 Cas9Nicknase对DNA切割示意图:    2 北京英茂盛业生物科技有限公司 : 010‐62495135 Email: order@产品说明书 用pCas9/gRNA1或pCas9/gRNA3载体进行基因敲除流程  设计基因敲除靶点  本试构建pCas9/gRNA载体剂盒中包含构建pTYNE验证载体内容在pTYNE载体上进行靶点验证pCas9/gRNA载体与筛选载体共pCas9/gRNA载体与重组载体共转染目的细胞转染目的细胞挑选转染阳性细胞,检测敲除效挑选转染阳性细胞,检测敲除效果果3 北京英茂盛业生物科技有限公司 : 010‐62495135 E