CRISPR核酸酶载体试剂盒说明书.docx

(ds)对照寡核苷酸序列ds克隆对照的寡核苷酸的序列如下所列。ds克隆对照的寡核苷酸来自退火的,并在试剂盒中提供的50μM的双链寡核苷酸。ds克隆对照的寡核苷酸在应用于连接反应之前需要进行再退火和稀释。5’CATTTCTCAGTGCTATAGAGTTTT3’3’GTGGCGTAAAGAGTCACGATATCT5’≥1×109cfu/-MCRAΔ(MRR-hsdRMS-mcrBC)φ80lacZΔM15ΔlacX74recA1araD139Δ(ARA-LEU)7697GalugalKpsL(STRR)?CRISPR核酸载体试剂盒便于产生表达CRISPRRNA和tracrRNA的非编码RNA以及在哺乳动物细胞中Cas9核酸酶介导的靶基因的裂解或基因编辑的结构体。该Cas9核酸酶是基于从细菌化脓性链球菌II型CRISPR/Cas系统,并经过精心设计的基因组编辑在哺乳动物系统(Jinek等人,2012;。Mali1等人,2013;。cong等人,2013)。带有OFP的GENEART?CRISPR核酸载体允许Cas9和CRISPRRNA的基于流式细胞仪表达的细胞群的分选,而带有CD4的GENEART?CRISPR核酸载体使Cas9与CRISPRRNA为基础的表达细胞的富集。线性GENEART?CRISPR核酸载体提供快速和有效的方式来克隆编码所需CRISPRRNA靶到表达盒,允许Cas9核酸序列中的特定的方式靶向的双链寡核苷酸。虽然该工具包被设计来表达Cas9和引导RNA的代表以最简单,最直接的方式,使用该试剂盒的基因组编辑和靶位点的特定靶序列裂解分析假设用户熟悉的CRISPR系统,载体的原则为基础的生产CRISPRRNA,并转染哺乳动物系统。我们强烈建议用户拥有CRISPR系统的工作知识。(Jinek等人,2012)原核适应性免疫系统。在细菌中CRISPR位点组成的串联重复序列由外源DNA片段的分离(?30bp的长度),称为间隔件。的重复间隔件阵列被转录为一个长的前体和重复序列内被处理,以产生用于指定由CRISPR核酸酶裂解的靶序列(也被称为protospacers)小crRNAs。CRISPR间隔物,然后用于识别和沉默的RNA或DNA水平的外源遗传元件。必不可少的裂解是一个序列基序紧接在目标区的3'端,被称为protospacer相邻的基序(PAM)的下游。在PAM中存在的靶DNA,但不能靶向它的crRNA。,以从基因组DNA中的特定位置中插入,删除或取代DNA序列。设计好的核酸酶在基因组中的特定位置诱导双链断裂(DSB),在这之后的内源性修复机制通过非同源末端连接(NHEJ)或同源性定向修复修复断裂。II型CRISPR系统已被证明可作为在各种生物体,包括哺乳动物细胞的基因的编辑工具。(Mali1等人,2013;cong等人,2013)。它由三部分组成:CRISPR相关Cas9核酸(双链DNA的核酸内切酶),靶互补CRISPRRNA(crRNA),和一个辅助反式激活crRNA(tracrRNA)。该crRNA和tracrRNA作为一个短导的RNA为目标的Cas9核酸酶对特定基因组位点(图1)。图1CRISPR/Cas9介导的靶DNA裂解示意图该crRNA和GENEART?CRISPR核酸载体的tracrRNA可以表示在一起为指导RNA,模仿在细菌系统自然crRNA-tracrRNA杂交。引导RNA的表达是由U6polIII启动型的启动子(图2)驱动。在GENEART?CRISPR核酸载体图2指南的RNA表达盒。该系统具有通用性,且易于使用,改变目标专一只需要变更CRISPRRNA的设计即可。?CRISPR核酸酶载体和表达它的细胞所需的步骤。步骤操作1设计的单链DNA寡核苷酸。2退火单链寡核苷酸,以产生一个双链寡核苷酸3稀释双链寡核苷酸对到工作浓度4克隆双链寡核苷酸到CRISPR核酸载体上5转化OneShot?,并选择表达克隆6通过测序分析转化子中存在的插入