CRISPR Cas9基因敲除载体构建试剂盒说明书V1.1.pdf

CRISPR Cas9 基因敲除试剂盒 
产品说明书 
 
 
 
本说明书适用于以下产品: 
 
货号货号
CRISPR/Cas9 试剂盒  CR0001 
CRISPR/Cas9Nick 试剂盒  CR0002 
pCas9/gRNA1 载体  CR1001 
pCas9/gRNA3 载体  CR1004 
pTYNE 验证载体  CR1011 
 
 
 
 
 
      北京英茂盛业生物科技有限公司 
      北京市昌平区沙河镇青年创业大厦 B‐916 
      Tel:010‐62495135 
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产品说明书 
产品内容 
Cas9 基因敲除试剂盒  货号 CR0001 
内容  包装 
pCas9/gRNA1  载体  3ug in TE Buffer 
pTYNE 验证载体  3ug in TE Buffer 
pCas9‐P 阳性对照载体  3ug in TE Buffer 
pCas9‐N 阴性对照载体  3ug in TE Buffer 
Cas9Nicknase 基因敲除试剂盒  货号 CR0002 
内容  包装 
pCas9/gRNA3 载体  3ug in TE Buffer 
pTYNE 验证载体  3ug in TE Buffer 
pCas9‐Pf 阳性对照载体  3ug in TE Buffer 
pCas9‐Pr 阳性对照载体  3ug in TE Buffer 
pCas9/gRNA1  载体  货号 CR1001 
内容  包装 
pCas9/gRNA1  载体  3ug in TE Buffer 
pCas9/gRNA3  载体  货号 CR1004 
内容  包装 
pCas9/gRNA3  载体  3ug in TE Buffer 
pTYNE 验证载体  货号 CR1011 
内容  包装 
pTYNE 验证载体  3ug in TE Buffer 
 
保存条件: 
‐20℃冻存 
 
 
 
 
所需其他材料 
¾ EcoRV  限制性内切酶。T4 DNA ligase。 
¾ dH5a、Top10 或其他常用感受态细胞。 
¾ 细胞培养基及其他细胞培养相关试剂。 
¾ HEK293T 细胞或 293V 细胞(货号 C1201)。 
¾ 转染试剂(Polyfect‐V 货号 P2010‐1)。 
  
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产品说明书 
CRISPR Cas9 基因敲除原理
CRISPR (clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats)是一种来自细菌降解入侵的病毒 DNA 或其
他外源 DNA 的免疫机制。在该机制中,Cas 蛋白(CRISP‐associated protein)含有两个核酸酶结构域,可以
分别切割两条 DNA 链。一旦与 crRNA(CRISPR RNA)和 tracrRNA 结合形成复合物,Cas 蛋白中的核酸酶即
可对与复合物结合的 DNA 进行切割。切割后 DNA 双链断裂从而使入侵的外源 DNA 降解。 
1、Cas9 蛋白 
来自 us pyogenes  的 Cas9 由于 PAM 识别序列仅为 2 个碱基(GG),几乎可以在所有的基因中找
到大量靶点,因此得到广泛的应用。Cas9 蛋白在目前测试过的几乎所有生物和细胞中均有活性,包括细菌、
酵母、植物、鱼、以及哺乳动物细胞。识别 RNA(gRNA)可以通过载体表达或者化学合成后与 Cas9 蛋白
共同进入细胞,对特异 DNA 序列剪切,从而促使 DNA 发生 NHEJ ( nonhomologous end‐joining)导致的基因
缺失或同源重组,实现基因敲除。 
Cas9 对 DNA 切割示意图: 
 
2、Cas9Nicknase 蛋白 
Cas9Nicknase 是 Cas9 蛋白的 D10A 突变体,切割 DNA 单链。由于 DNA 上的 Nick 缺口会很快被细胞修复,
一般不会造成基因突变。Cas9Nicknase 需要成对的 gRNA 辅助才能实现 DNA 双链断裂。 
采用 Nicknase 蛋白可以提高基因敲除