中国药科大学生物制药工艺实验指导.doc

中国药科大学生物制药工艺实验指导第二部分生物药物制备实验第一节氨基酸及其衍生物类药物实验二十二固定化细胞法生产L-天冬氨酸和L-丙氨酸注:此实验来自项目固定化细胞生产天‎‎冬氨酸,丙氨酸(国家攻关课题)的成果【实验目的】1(学习L-天冬氨酸和L-丙氨酸的制备方法。2(了解酶法生产这两种氨基酸的原理和细胞固定化的原理及优点。3(掌握固定化细胞的技术。【实验原理】固定化细胞(Immobilizedcell)技术,就是利用物理或化学手段将游离的微生物细胞、动物细胞,定位于限定的空间领域,并使其保持活性且能反复利用的一项技术。固定化细胞的制备方法主要有以下几种:吸附法、共价交联法、絮凝法、包埋法;交联可以是细胞通过离子相互作用或共价连接到一个表面,也可以是细胞与细胞之间用过天然或化学试剂诱导产生连接;吸附法是细胞通过静电相互作用(范德华力、离子键和氢键)吸附到支持物表面,此法简单价廉,但经常发现有细胞泄露;絮凝法是利用某些微生物细胞具有絮凝形成颗粒的能力而对细胞进行固定化的方法;包埋法是近年来发展迅速的,减少了细胞一种新兴固定化细胞技术,它是将细胞捕获在一个保护性基质结构或胶囊中泄露,因此具有操作简单,对细胞活性影响较小,效率高等特点,是目前细胞固定化研究和应用最广泛的方法之一。L-天冬氨酸(L-Asparticacid)是天然存在的重要氨基酸,在食品、医药、日用化工、纺织等行业有着广泛的应用。L-天门冬氨酸钾、镁盐在细胞代谢中起着重要作用,是钾、镁的有效补充剂,适用于各种心脏病。在食品方面,L-天冬氨酸作为食品添加剂可改善食品风味,L-天冬氨酸与D-丙氨酸可合成L-天冬酰-D-丙氨酸甲酯(其甜度为蔗‎‎糖的150倍),是一种新型甜味剂。在化工方面,L-天冬氨酸还可以作为制造合成树脂的原料,其衍生物还可以合成量型表面活性剂以及制造化妆品。工业上生产L-天冬氨酸以往采用化学合成法和微生物发酵法。随着固定化酶和固定化细胞技术的不断完善和发展,人们开始改用含有天冬氨酸酶的固定化细胞直接将延胡索酸铵转化成L-天冬氨酸来实现工业化生产。L-丙氨酸(L-Alanine)是一种脂肪族的非极性氨基酸,是丙酮酸代谢体系的非必需氨基酸,在血液中含量最多,与糖代谢密切相关,使转氨反应中重要的氨基供体,具有重要的生理功能;同时又是一种重要的氨基酸类药物,为多种复方氨基酸输液的重要组成成分,并可作多种医药中间体。本实验用卡拉胶包埋天冬氨酸酶产生菌和L-天冬氨酸β-脱羧酶产生菌制成固定化细胞,利用生物反应器,可连续生产L-天冬氨酸和L-丙氨酸。77【实验材料】1(器材(1)水浴振摇培养箱1台(2)磁力搅拌器1台(3)HPLC1台(4)三角烧瓶250ml5个(5)抽滤瓶1个(6)离心机1台(7)布式漏斗2只(8)恒温水浴锅1台(9)酶柱1根(10)烧杯1000ml1个(11)烧杯500ml2个(12)烧杯250ml2个(13)超级恒温水浴1台(14)恒流泵1台(15)高压灭菌锅1个(16)锋利小刀1把(17)试管12支2(试剂(1)菌种(2)玉米浆(3)延胡索酸铵(4)PLP(5-磷酸吡哆醛)(5)牛肉浸膏(6)KH2PO4(7)MgSO4?7HO2(8)浓氨水(9)氯化钾(10)氯化镁(11)浓硫酸(12)95,乙醇(13),-天冬氨酸标准品(14)延胡索酸标准品(15),-丙氨酸标准品【实验方法】1(细菌的培养及菌体制备78接种1ml对数生长期天冬氨酸酶产生菌种至250ml三角烧瓶中,内含50ml已经灭菌的培养基(1%延胡索酸铵,2%玉米浆,2%牛肉浸膏,%KH2PO,%MgSO4•7HO,),4237?振摇培养24h,培养液离心(3000r/min,20min)倾出上清液,再用生理盐水洗涤1次,离心收集菌体,置冰箱备用。接种1ml对数生长期L-天冬氨酸β-脱羧酶产生菌种至250ml三角烧瓶中,内含50ml已灭菌的培养基(%L-谷氨酸钠,%富马酸铵,1%富马酸钠,%玉米浆,2%蛋白胨,%KH2PO,%MgSO4•7HO,),37?振摇培养24h,培养液离心(3000r/min,4220min)倾出上清液,再用生理盐水洗涤一次,离心收集菌体,置冰箱备用。2(固定化细胞的制备(1)天冬氨酸酶产生菌的固定化将4g湿菌体悬浮于4ml生理盐水中,置45?恒温水浴保温,,加热至70-80?使之溶解,再降温至45?,两者于45?混匀,混合物置4?冰箱放置30min,,然后切成3mm×3mm×3mm的立方体颗粒。经生理盐水洗涤后,将固定化细胞置于1mol/L延胡索酸铵中,于37?活化24h,即可使用。(2)L-天冬氨酸β-