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实验二淀粉酶活性的测定预习报告生物 094 左宇 0902040409 一、研究背景: 酶作为生物体内催化剂, 测定其活力是非常有必要的。不同种类的酶的活力测定方法不同, 我们将通过在细节设计上差异较大的酶活力测定方法的设计细节的分析和具体酶活测定操作, 体会分析比较其设计细节的差异, 从而获取相关设计理念并完成没活力测定实验操作的训练。二、研究目标: 按照淀粉酶水解淀粉的作用方式, 可以分为α- 淀粉酶和β- 淀粉酶等。根据其催化产物的特点和现有测定方法规定酶活力单位为: 每分钟每克鲜重麦种所催化生成的麦芽糖毫克数,来对这两种酶进行有效的测定。三、研究策略: 两种淀粉酶特性不同,α- 淀粉酶不耐酸,在 以下迅速钝化;β- 淀粉酶不耐热,在 70℃ 15min 钝化。根据它们的这种特性, 在测定活力时钝化其中之一, 就可测出另一种淀粉酶的活力。本实验采用加热的方法钝化β- 淀粉酶,测出α- 淀粉酶的活力。在非钝化条件下测定淀粉酶总活力( α- 淀粉酶活力+β- 淀粉酶活力) ,再减去α- 淀粉酶的活力,就可求出β- 淀粉酶的活力。四、研究方案及可行性分析:两种酶作用淀粉的方式不同。α- 淀粉酶可随机地作用于淀粉中的α-1,4- 糖苷键,生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖,同时使淀粉的粘度降低,因此又称为液化酶。β- 淀粉酶可从淀粉的非还原性末端进行水解,每次水解下一分子麦芽糖,又被称为糖化酶。淀粉酶催化产生的这些还原糖能使 3,5- 二硝基水杨酸还原, 生成棕红色的 3- 氨基-5- 硝基水杨酸。淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成正比。用标准浓度的麦芽糖溶液制作标准曲线,用比色法测定淀粉酶作用于淀粉后生成的还原糖的量, 以单位重量样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。五、具体实验设计 1 、所需的主要材料、试剂、仪器(1 )实验材料:小麦种子(2) 实验仪器: 离心机、离心管、研钵、电炉、容量瓶( 50mL × 1,100mL ×1)、恒温水浴、分光光度计。(3 )实验试剂: 1% 淀粉溶液、 pH 的柠檬缓冲液( A 液、 B液)、 3,5- 二硝基水杨酸溶液、麦芽糖标准液( 1mg/ml )、 NaOH 。 2 、具体操作步骤(单页流程图) ⑴样品制备: 2 克萌发的小麦种子→匀浆→少量多次用蒸馏水转移至 50ml 容量瓶约至 40ml →浸提 15-20 分钟→定容→混匀→离心→取上清液备用(初始酶液)。⑵α- 淀粉酶活性的测定:试管 4 支(两只对照、两只测定) →加1 毫升酶提取液→ 70 ℃恒温水浴加热 15 分钟→冰浴中冷却→各加入 1ml pH 的柠檬缓冲液→ 40℃恒温水浴保温 15 分钟→两只对照管中各加入 4ml NaOH →各管中加入 40℃下预热的淀粉溶液 2ml →摇匀→立即于 40℃水浴中保温 5 分钟→两只测定管中分别迅速加入 4ml NaOH →摇匀→准备下步糖的测定。⑶α- 淀粉酶和β- 淀粉酶总活性的测定: 取所制备的酶液 5ml →放入 100ml 容量瓶中→用蒸馏水稀释至刻度→混合均匀→取4 支试管( 两只对照、两只测定)→加1 毫升酶提取液→各加入 1ml pH 的柠檬缓冲液→ 40℃恒温水浴保温 15 分钟→两只对照管中各加