吲哚乙酸氧化酶检测试剂盒(IAA比色法).doc

吲哚乙酸氧化酶检测试剂盒(IAA比色法)
北京雷根生物技术有限公司
简介:
植物体内生长素的种类很多,其中吲哚乙酸(IAA)是植物体内普遍存在的一种生长素,植物体内IAA的含量,对于植物的生长、发育、衰老、脱落等均有重要意义。植物体内存在吲哚乙酸氧化酶(Indoleacetic acid oxida-se),该酶是植物体内一种氧化分解吲哚乙酸的酶,吲哚乙酸氧化酶能够氧化IAA使其失去活性,从而调节体内IAA的水平,影响植物的生长。
组成:
自备材料:
1、恒温箱或水浴锅
2、研钵或匀浆器
3、离心管或试管
4、低温离心机
5、浓硫酸
6、比色杯
7、分光光度计
操作步骤(仅供参考):
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1、准备样品:
①植物样品:将大豆或绿豆等种子置于30℃中避光萌发3-4天,选取生长一致的幼苗,除去子叶和根,留下胚轴作为材料。取胚轴,称重,按每100mg加入适量预冷的 IAA Lysis buffer的比例,冰浴情况下充分匀浆或研磨。离心,留取上清液即为吲哚乙酸氧化酶粗提液。短期4℃保存待用。
②血浆、血清和尿液样品:血浆、血清按照常规方法制备后可以直接用于本试剂盒的测定,保存,用于吲哚乙酸氧化酶的检测。
③细胞或组织样品:取恰当细胞或组织裂解液,如有必要用IAA Lysis buffer进行适当匀浆,离心,取上清液,-4℃保存,用于吲哚乙酸氧化酶的检测。
④高活性样品:如果样品中含有较高活性的吲哚乙酸氧化酶,可以使用IAA Lysis buffer工作液进行恰当的稀释。
2、配制IAA显色工作液:取适量的IAA 显色液,按IAA 显色液:蒸馏水:浓硫酸一定的
比例混合,即为IAA显色工作液。配制好的IAA显色工作液4℃密闭保存,即配即用,不易久置。注意:浓硫酸为强腐蚀性物质,操作须极其小心。
4、样本处理:按照下表设置对照液、测定液,溶液应按照顺序依次加入,并注意避免产生
气泡。
5、 IAA加样:按照下表设置空白管、对照管、测定管,溶液应按照顺序依次加入,并注意
避免产生气泡,取若干离心管或试管先加入AA显色工作液,再分别加入对照液、测定液,小心混匀,孵育,使反应液呈红色。如果样品中的吲哚乙酸氧化酶活性过高,可以减少样品用量或适当稀释后再进行测定。样品的检测最好能设置平行管,求平均值。
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6、IAA测定:以分光光度计,1cm光径比色杯,以空白管调零,测定标准管、对照管、测定管530nm处吸光度(记为A标准、A对照、A测定)。
计算:
吲哚乙酸氧化酶活性定义:以吲哚乙酸氧化酶提取液氧化的吲哚乙酸量(mg)表示酶活力大小。
以1-8号管系列IAA标准溶液浓度(5、10、15、20、25、30、35、40μg/ml)为横坐标,以对应的吸光度为纵坐标,绘制标准曲线,直接计算直线回归方程。组织样品的吲哚乙酸氧化酶活性(μg/ml·g·h)={(C1-C2)×V×VT}/(W×t×V1) 式中:C1=根据标准曲线求得的对照管IAA含量(μg/ml) C2=根据标准曲线求得