04酶切重组质粒.doc

上海中医药大学
《分子生物学技术在中医药研究中的应用》教案(3)
课程名称分子生物学技术在中医药研究中的应用总学时数 48
专业中医基础和中医临床专业 授课教师方肇勤、管冬元、潘志强
内容
酶切质粒、电泳分离插入片断、凝胶中回收DNA片段
时数
7
本次课目的要求
了解限制性内切酶及其生物学特性。
掌握选用内切酶切割质粒的理论与技术。
电泳鉴定酶切结果的理论与技术。
从凝胶中回收DNA的理论与技术。
本次课的重点难点
限制性内切酶及其生物学特性。
限制性内切酶切割质粒及常见问题。
灌制凝胶。
电泳鉴定酶切结果与分析。
从凝胶中回收DNA。
本次课的应用教具
内切酶切割质粒实验及有关仪器设备。
电泳鉴定酶切实验及有关仪器设备。
从凝胶中回收DNA实验及有关仪器设备。
实验29
酶切重组质粒,电泳分离所插入的DNA

。鉴定所培养的单菌落中是否含有重组质粒,或仅含有自身环化的质粒。如前所述,前者电泳后会出现大小不等的两条DNA条带,一条为线性质粒载体的DNA,另一条为插入的目的基因;后者仅有一条载体的DNA条带。比如DDPCR、RACEPCR、细胞库筛选、基因重组,等。
。通过电泳分离,使载体与插入目的基因分开,便于分别回收载体和已大量扩增了的插入目的基因。比如探针用片段。
:
1)酶切重组质粒;
2)DNA的琼脂糖凝胶电泳(纯化的方法)。

本实验选用的限制性内切酶是分子生物学中最为常用的工具酶。通常不同的限制性内切酶分别能识别一小段双链DNA序列,长度多在4-6个核苷酸,且呈双重对称的DNA序列,并将其切断。
利用这种特性,可以选择适当的酶来切割所需的DNA片段,或选择适当的酶切开载体,造成载体的粘端序列与插入DNA的粘端序列相同,以便于重组质粒。具体酶的特性、识别位点等可以参考不同公司的试剂目录(见图)。

DNA的琼脂糖凝胶电泳是分子生物学实验中使用广泛的技术,该技术利用DNA分子在电场下向电场一极迁徙的特性,在pH中性的条件下,DNA分子由阴极向阳极迁徙。其间,DNA分子量大,摩擦阻力大,在凝胶的孔隙中迁徙得慢;分子量小,摩擦阻力小,迁徙快,在电泳一定时间后,大小不等得DNA分子可以得到有效得分离。同样分子量的DNA环状的较线性的迁徙速度快。分离的DNA可以方便地用溴乙锭染色,方法是1)在灌胶时直接把溴乙锭混入凝胶,或2)电泳后将凝胶浸入溴乙锭染液(我们推荐前者),染色后在紫外透射灯下可以看到橘红色的DNA条带,在一般实验室最低分辨能力(肉眼可见的)约为50-100ng。
电泳仪介绍(见图)。
电泳仪放法(见图)。
原理
采用限制性内切酶EcoR I切开插入DNA与质粒载体,将这一反应液上样于琼脂糖凝胶,电泳,使分子量小的插入DNA前移,并与分子量大的在电泳中滞后的质粒载体DNA分开。(见图)
实验准备(略)
实验步骤

Eppendorf管,编好号,插入冰中,依次加入:
水 7ul
10×缓冲液 2ul
重组质粒 10ul
EcoR I 1ul
20ul
盖上盖,混匀,将反应物甩入管底,置37℃水浴中温育1