聚合酶链式反应PCR实验报告.doc

实验二 聚合酶链式反应（

PCR

）
一、 实验原理
聚合酶链式反应（ PCR
实验二 聚合酶链式反应（

PCR

）
一、 实验原理
聚合酶链式反应（ PCR 是利用 DNA 片段旁侧两个短的单链引物，在体外快速扩 增特
异 DNA 片段的技术。它应用热稳定的聚合酶，通过双链 DNA 莫板的热变性、
引物退火和引物延伸的重复循环， DNA 片段以指数方式增加了百万倍。从非常微 量
的 DNA 甚至单个细胞所含有的 DNA 起始，可产生 ug 量的 PCF 产物。
二、器材与试剂
1. 器材：移液器， EP 管，热盖 PCR 仪，电泳仪，量筒，锥形瓶，微波炉，电子 天平，紫外照色仪
试剂：引物，模板， Taq DNA R 合酶，原料（ dNTPS ，缓冲液与 Mg2+H2O, 2*PCRmix 溶液， DNA 染料
三、 实验步骤
PCF 反应体系的建立
取离心管，依次加入试剂混匀
1.
H2O
12卩 I
2 ?模板
1
卩 I
3.
引物T71 卩I
4.
引物 sp6 1 卩 I
5.
2*PCRmix 15
卩 l
PCR 仪的热循环反应
把离心管放入 PCR 仪中，由变性 --退火 --延伸三个基本反应步骤构成
1.
模板 DNA 勺变性：模板 DNA 经加热至 94C 左右一定时间后，使模板
DNA 双链
或经 PCR 扩增形成的双链 DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为
下
轮反应作准备；
模板 DNA 与引物的退火 （复性）: 模板 DNA 经加热变性成单链后，温度降至 56C 左右，引物与模板 DNA 单链的互补序列配对结合；
引物的延伸：经加热至 72C 左右 DNA 模板 --引物结合物在 TaqDNA 聚合酶的 作
用下，以 dNTP 为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制 原
理，合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链。重复该循环 30 次， 每
次需要 2-3 分钟。
电泳检测结果
扩增产物在琼脂糖凝胶电泳中， 电泳结束后， 放到紫外照射仪中进行透射， 电泳
明胶显示清晰的条带，如下图所示 加入的为 1 号样，出现在 500bp 左右条带， 而预
算结果为扩增出 492bp 条带，故实验成功。
四、 讨
Mg2+ 离PCR扩响很大, 可降 低 的浓 度 过
PCR扩至
使 失败而
条带。
变性温 性
时间 可能
出 退火温
可致非 增
而